糖多孢紅霉菌突變體M生物合成3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B的限速因子研究.pdf

1、紅霉素(erythromycin，Er)是糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)的次生代謝產(chǎn)物,為一類廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。近幾年上市的第三代大環(huán)內(nèi)酯類紅霉素及其衍生物(又稱為酮內(nèi)酯類抗生素ketolide antibiotics),因具有較高的抗菌活性和顯著的抑制呼吸道耐藥菌株活性而具有廣闊的開發(fā)前景。為探尋經(jīng)基因工程途徑直接改造糖多孢紅霉菌的染色體結(jié)構(gòu)而合成的新酮內(nèi)酯類化合物DOEB產(chǎn)量大大下降的原因

2、,本文以糖多孢紅霉菌突變體M為研究對象,分別從基因的轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和內(nèi)酯類化合物前體水平,系統(tǒng)研究了糖多孢紅霉菌M合成DOEB的限速因子。研究結(jié)果如下:
　　在mRNA穩(wěn)定性研究中,首先提取、純化糖多孢紅霉菌總RNA,進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄,以獲得的cDNA為模板,采用ABI real-time quantitive7500儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增,實時監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,計算mRNA的相對表達(dá)量(RQ=2-△△Ct),其中M菌株P(guān)K

3、S-TE基因表達(dá)量是A226菌株P(guān)KS-TE基因表達(dá)量的0.65倍,平均下調(diào)了0.35倍;M菌株P(guān)KS-ACP基因表達(dá)量是A226菌株P(guān)KS-ACP基因表達(dá)量的0.69倍,平均下調(diào)了0.31倍。結(jié)果表明經(jīng)基因工程改造的糖多紅霉菌mRNA表達(dá)量稍顯降低,其穩(wěn)定性未受到明顯影響。因為突變體DOEB產(chǎn)量下降千倍左右,所以mRNA轉(zhuǎn)錄水平并不是DOEB生物合成的限速因子。
　　在PKS蛋白穩(wěn)定性研究中,以PKS復(fù)合體上的TE酶域為研究對象

4、,采用生物信息學(xué)對TE蛋白氨基酸序列分析,化學(xué)合成抗原免疫家兔,分離抗血清，Elisa鑒定抗體效價。此后提取糖多孢紅霉菌A226/M不同時期總蛋白,Bradford法測定其濃度,取等量的各時期菌蛋白與抗體進(jìn)行ELISA檢測,數(shù)據(jù)結(jié)果表明突變體M比工程菌A226蛋白表達(dá)量稍有降低,基因突變后PKS蛋白的穩(wěn)定性亦未受到明顯影響。同時取等量的各時期總蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)-銀染復(fù)染法檢測PKS蛋白復(fù)合體的表達(dá)情況,進(jìn)一步證明突變體M和工程菌A22

5、6合成的PKS蛋白復(fù)合體表達(dá)量沒有明顯差異,排除了翻譯水平的限速因子可能性。
　　在DOEB及其前體穩(wěn)定性研究中,提取糖多孢紅霉菌M和A226不同時期的發(fā)酵液,利用LC-MS技術(shù)檢測DOEB及其前體表達(dá)水平。結(jié)果表明,造成M突變體DOEB產(chǎn)量下降的原因是由于在KR6突變菌株合成DOEB前體模塊的過程中,相對于A226菌株而言,模塊5產(chǎn)物的起始合成量降低,并且隨著發(fā)酵時間的增加,模塊5產(chǎn)物檢測量增大,發(fā)生了累積;同時,合成的DODE