水稻硝運(yùn)輸輔助蛋白基因OsNAR2s表達(dá)特征和功能分析.pdf

1、水稻(Oryza sativa L.)不僅是世界上主要的糧食作物之一；而且是單子葉作物研究的重要模式植物(基因組小以及全基因組測序完成).氮素(N)是農(nóng)作物產(chǎn)量的重要限制因子,銨態(tài)氮(NH4+)和硝態(tài)氮(NO3-)是植物從土壤中吸收的主要礦質(zhì)氮源。盡管在淹水條件下土壤中氮素主要以銨態(tài)氮形式存在,但是有研究表明水稻根系能夠泌氧,從而在硝化細(xì)菌作用下將根際土壤中銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮；還有在水稻生長發(fā)育的后期由于干濕交替的灌溉方式使得土壤中存在

2、大量的硝態(tài)氮,在潮濕土壤狀況下水稻根系吸收硝態(tài)氮占總氮量的40％。然而關(guān)于水稻是如何吸收硝態(tài)氮的生理與分子機(jī)制方面報(bào)道還很少。在擬南芥、大麥上發(fā)現(xiàn)高親和硝態(tài)氮運(yùn)輸是通過雙組分系統(tǒng)(NAR2s、NRT2s)來實(shí)現(xiàn)的,其運(yùn)輸?shù)鞍滓约拜o助蛋白基因的功能已經(jīng)被鑒定。本論文主要從以下幾個(gè)方面入手:半定量RT-PCR分析OsNAR2s和OsNRT2s表達(dá)模式；蛙卵異源表達(dá)研究水稻雙組份硝態(tài)氮運(yùn)輸系統(tǒng)；利用RNAi技術(shù)獲得OsNAR2.1突變體；半定

3、量RT-PCR、定量RT-PCR和Western雜交分析突變體OsNAR2.1沉默效果；15N分別標(biāo)記NH4+和NO3-分析osnar2.1突變體對氮素吸收；電生理測定osnar2.1突變體根系細(xì)胞對NO3-響應(yīng)；不同氮素形態(tài)培養(yǎng)下osnar2.1突變體根系形態(tài)和產(chǎn)量分析；基因芯片分析可能受OsNAR2.1直接或間接調(diào)控的基因,從而了解水稻硝態(tài)氮運(yùn)輸輔助蛋白基因是如何影響水稻對硝態(tài)氮吸收以及在其它方面可能作用的生理與分子機(jī)制。主要研究結(jié)

4、果如下:
　　 1)利用半定量RT-PCR分析了OsNAR2s和OsNRT2s的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)OsNAR2.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a以及OsNRT2.4表達(dá)都受硝態(tài)氮誘導(dǎo),但是都受銨態(tài)氮和天冬氨酸強(qiáng)烈抑制,而OsNAR2.2和OsNRT2.3b表達(dá)不受氮形態(tài)以及四個(gè)氨基酸影響(Glu、Gin、Asp、Asn),OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a以及OsNRT2.4表達(dá)還受谷氨

5、酰胺和天冬酰胺抑制,而OsNAR2.1表達(dá)不受影響；所有OsNAR2s和OsNRT2s家族基因表達(dá)不受硝態(tài)氮濃度的影響；另外在這些基因當(dāng)中,除了OsNRT2.3b和OsNRT2.4在葉片中表達(dá),而且OsNRT2.4在葉片表達(dá)比在根系中強(qiáng),其余基因都在根系中表達(dá)。
　　 2)蛙卵異源表達(dá)研究水稻硝態(tài)氮運(yùn)輸雙組份系統(tǒng)。結(jié)果表明OsNAR2.1不僅能夠促進(jìn)OsNRT2.1/OsNRT2.2(兩個(gè)基因的蛋白一樣)對硝態(tài)氮的吸收,而且還能

6、夠促進(jìn)OsNRT2.3a對硝態(tài)氮的吸收,但是比OsNRT2.3a少30個(gè)氨基酸的OsNRT2.3b卻能夠獨(dú)立地吸收硝態(tài)氮,而不需要OsNAR2.1的幫助.OsNAR2.1的同源蛋白OsNAR2.2不能代替其行使相互作用的功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OsNRT2.1/OsNRT2.2和OsNAR2.1對硝態(tài)氮的親和力Km值為0.034 mM；OsNRT2.3a和OsNAR2.1對硝態(tài)氮的親和力Km值為0.31 mM,前者的Km值是后者的將近1/1

7、0。因此,在低外界硝態(tài)氮濃度下前者起主要作用,而在高外界硝態(tài)氮濃度下后者起主要作用。
　　 3)利用RNAi干擾技術(shù)獲得OsNAR2.1沉默效果較好的兩個(gè)突變體株系。定量RT-PCR分析它們的沉默效率分別為84.6％(r1)、79.1％(r2)。進(jìn)一步通過OsNAR2.1蛋白特異性抗體進(jìn)行Western雜交分析發(fā)現(xiàn)osnar2.1突變體兩個(gè)株系蛋白表達(dá)量也顯著下降了。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)OsNAR2.1沉默以后還抑制硝態(tài)氮運(yùn)輸?shù)鞍谆騉s

8、NRT2.1、OsNRT2.2幫OsNRT2.3a表達(dá),而OsNAR2.2、OsNRT2.3b、OSNRT2.4和OsNRT1.1的表達(dá)沒有受到影響。因此,OsNAR2.1可能直接或間接調(diào)控OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.3a表達(dá)。
　　 4)利用15N分別標(biāo)記NH4+和NO3-分析osnar2.1突變體對氮素吸收。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsNAR2.1沉默后,水稻對銨態(tài)氮吸收沒有受到影響,但是不僅低濃度硝態(tài)氮吸收顯著減少,

9、而且高濃度硝態(tài)氮吸收也顯著減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在0.2 mM NO3-條件下兩個(gè)突變體株系對硝態(tài)氮吸收速率比野生型植株分別下降了84-86％,即使在5 mMNO3-條件下它們對硝態(tài)氮吸收速率比野生型植株也分別下降了69-73％。離子選擇性微電極研究突變體對硝態(tài)氮響應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體根系細(xì)胞不再響應(yīng)低濃度硝態(tài)氮,而對高濃度硝態(tài)氮響應(yīng)也小于野生型根系細(xì)胞。所有這些都證實(shí)了osnar2.1突變體植株對高和低濃度的硝態(tài)氮吸收都受到破壞。

10、　　 5)研究不同氮濃度以及氮形態(tài)(0.2 mM NO3-、5 mM NO3-和0.2 mM NH4+)培養(yǎng)下osnar2.1突變體苗期生長情況。結(jié)果表明在0.2 mM NH4+條件下兩個(gè)突變體株系和野生型植株生長沒有顯著差異,而在0.2 mM NO3-培養(yǎng)下,兩個(gè)突變體株系長的明顯小于野生型植株,而且它們的葉片發(fā)黃、出現(xiàn)缺氮癥狀。兩個(gè)突變體株系地上部和根系的生物量、總氮濃度也都顯著低于野生型植株,即使在5 mM NO3-培養(yǎng)下,兩個(gè)

11、突變體株系和野生型植株在地上部和根系的生物量以及總氮濃度這些方面也都存在顯著差異。抽穗期后氮素處理實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn),還發(fā)現(xiàn)在0.2 mM NO3-和5 mM NO3-培養(yǎng)下兩個(gè)突變體株系的結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量都要遠(yuǎn)低于野生型植株。
　　 6)研究了OsNAR2.1沉默對水稻根系形態(tài)的影響。發(fā)現(xiàn)在含有0.2mM NO3-垂直瓊脂平板培養(yǎng)下兩個(gè)突變體株系的主根和野生型植株沒有顯著差異,但是它們的側(cè)根長度顯著短于野生型植株。而在0.2 mM

12、 NH4+條件下它們的根系形態(tài)沒有顯著差異,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與擬南芥影響側(cè)根發(fā)育信號途徑關(guān)鍵基因ANR1水稻同源的基因OsMADS在osnar2.1突變體中表達(dá)受到抑制,而且受硝態(tài)氮誘導(dǎo)表達(dá)。因此推測OsNAR2.1對水稻根系形態(tài)的影響可能是通過抑制OsMADS的表達(dá)進(jìn)而影響水稻側(cè)根的生長。
　　 7)利用基因芯片技術(shù)分析在0.2 mM NO3-培養(yǎng)下osnar2.1突變體全基因組表達(dá)。結(jié)果再次表明OsNAR2.1沉默影響水稻對硝

13、態(tài)氮吸收和利用,還有一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)是突變體中氧氣的運(yùn)輸受到抑制。進(jìn)一步研究分析與擬南芥控制通氣組織形成途徑中關(guān)鍵基因的水稻同源基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)OsPAD4在osnar2.1突變體中表達(dá)受到抑制,而且受硝態(tài)氮的誘導(dǎo)。
　　 綜述所述,水稻硝態(tài)氮運(yùn)輸輔助蛋白基因OsNAR2.1不僅能夠促進(jìn)OsNRT2.1/OsNRT2.2和OsNRT2.3a對硝態(tài)氮的吸收,而且還可能直接或者間接調(diào)控這三個(gè)基因的表達(dá)；OsNAR2.1沉默后不僅影響了水