乙型肝炎病毒PreS1單克隆抗體的制備及特性研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒(HBV)感染危害巨大，慢性乙肝至今仍缺乏有效的治療手段和解決方案，HBV感染機制的研究進展相對滯后是嚴重影響新型治療方法和藥物研發(fā)的重要原因之一。PreS1在HBV感染過程中具有很重要的作用，對于研究意義重大，但目前缺乏其特異性單克隆抗體，影響了其功能的深入研究。本研究通過原核表達純化PreS1蛋白，利用雜交瘤技術制備PreS1特異性單克隆抗體，為進一步研究奠定基礎。 方法： 1．采用PCR法擴增含H

2、indⅢ與Xba Ⅰ酶切位點的 PreS1 基因片段，原核表達載體pGST-MOLUC及PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，用 T<,4>DNA連接酶將兩者連接并轉化到大腸桿菌 JM109 構建并篩選重組質粒。隨后將重組質粒轉入表達宿主菌BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導表達，對表達蛋白進行SDS-PAGE電泳分析和 Western-blot檢測。以谷胱甘肽-Sepharose 4B凝膠為填料進一步采用親和層析純化融合蛋白。 2．用PreS1

3、 融合蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，采用雜交瘤技術，制備抗 PreS1的單克隆抗體，用ELISA方法篩選分泌抗PreS1 單克隆抗體的雜交瘤細胞株，采用間接ELISA 方法和Western-blot進行McAb特異性鑒定；同時采用間接ELISA 方法鑒定McAb的Ig亞類，檢測McAb的效價及相對親和力，并進行McAb結合表位分析。并對其染色體進行分析。 結果： 1．采用PCR方法擴增得到與預期大小一致的目的基因片段

4、。重組質粒經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析證實重組質?？寺〕晒?，命名為pGST-PreS1。轉化表達宿主菌后成功誘導出分子量為37kD的GST-PreS1 融合蛋白，與預期分子量相符，誘導表達融合蛋白約占總菌蛋白的10％左右。Western-blot檢測表明誘導表達的融合蛋白能分別與抗GST的單抗和抗PreS1的單抗發(fā)生特異性結合。采用谷胱甘肽-Sepharose 4B凝膠純化融合蛋白，純化蛋白純度約為90％左右。 2．成功篩選出兩株可分

5、泌特異性McAb的雜交瘤細胞P1A1和P283，其抗體亞類分別為IgG<,2b>，IgG<,3>；將生長良好的雜交瘤細胞接種到預處理的Balb/c 小鼠腹腔中制備腹水型PreS1的單克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)證明腹水效價可達10<'-7>；Western-blot 結果鑒定提示該單克隆抗體可以特異的結合PreS1。ELISA相加實驗結果顯示2株McAb識別不同的抗原表位。 結論：綜上所述，我們運用重組DNA技術與原