轉(zhuǎn)人類胰島素基因雞的研究.pdf

1、糖尿病是由于體內(nèi)胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足造成的一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病。目前糖尿病已經(jīng)成為繼心腦血管和腫瘤之后第三位嚴(yán)重危害人類健康的疾病。
　　 隨著人類社會(huì)的發(fā)展，營(yíng)養(yǎng)性肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)、老齡化等問題越來越嚴(yán)重，這將大大提高糖尿病的發(fā)病率。僅我國(guó)糖尿病患者的人數(shù)就高達(dá)3000 多萬，且每年仍以20[％]的速度遞增。而胰島素是機(jī)體降低血糖的唯一的一種激素，也是臨床上治療人類I型糖尿病的首選藥物，因此醫(yī)用胰島素的市場(chǎng)需求量也隨之加大。

2、而胰島素的生產(chǎn)方法從最初直接從人和動(dòng)物胰腺中提取，發(fā)展到利用不同生物類型的基因工程生產(chǎn)胰島素。雞蛋作為生物反應(yīng)器因其生產(chǎn)周期短、成本低、蛋白質(zhì)易于分離和純化等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為今后生產(chǎn)藥用蛋白的研究方向。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先是從人類胎兒胰腺中提取胰腺細(xì)胞總RNA，并依據(jù)Genbank 上公布的人類胰島素基因序列，利用primer5.0 生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，采用RT-PCR 法獲得了350bp的人類胰島素基因片段(INS)

3、，測(cè)序結(jié)果表明克隆的人類胰島素基因序列和Genbank 公布的一致。然后構(gòu)建出pUC57-INS，用于人類胰島素基因的保存和擴(kuò)增。最后再將INS 片段亞克隆到含有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1 上，后經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序等方法證明人類胰島素基因真核表達(dá)載體pEGFP-N1-INS 構(gòu)建成功，用于制備轉(zhuǎn)人類胰島素基因雞方面的研究。
　　 本試驗(yàn)采用了脂質(zhì)體包埋和雞胚顯微注射的方法將構(gòu)建好的pEGFP-N1-IN

4、S轉(zhuǎn)染至雞胚中來制備轉(zhuǎn)基因雞。先后收集河南盧氏綠殼蛋雞種蛋220 枚，設(shè)置未處理的20 枚種蛋為空白對(duì)照組孵化后，發(fā)現(xiàn)種蛋受精率為85[％]。轉(zhuǎn)基因操作后的200 枚種蛋在孵化過程中共獲得不同胚齡的死胚82 只，雛雞24 只，操作后未發(fā)育的轉(zhuǎn)基因種蛋94 枚。先后對(duì)82 只死胚進(jìn)行融合蛋白(人類胰島素與綠色熒光蛋白)的綠色熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4 只死胚組織有綠色熒光出現(xiàn)，蛋白陽性率為4.88[％]。然后再利用primer5.0 生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)