MiR29a-b1在鋁致Aβ沉積過程中的體外實驗研究.pdf

1、目的：
　　1.探討麥芽酚鋁暴露對大鼠皮質神經元細胞miR-29a、miR-29b1、BACE1和Aβ1-42表達的影響；
　　2.通過建立高表達miR-29a或miR-29b1的細胞模型，進一步探討miR-29a和miR-29b1在鋁致Aβ沉積過程中對BACE1表達的調控機制。
　　3.通過對神經元細胞體外干預實驗，探討NF-κB在鋁致miR-29a和miR-29b1異常表達中的作用。
　　方法：
　　1

2、.取新生24 h內的SD大鼠乳鼠的皮質進行原代神經元培養(yǎng)，培養(yǎng)至第三天時加入10μmol/L的阿糖胞苷，應用免疫組化法檢測神經元特異性表達蛋白Neuron-specific classⅢβ–Tublin的表達來進行神經元純度檢測。應用不同濃度麥芽酚鋁染毒大鼠皮質神經元細胞，劑量分別為空白對照組（0μmol/L）、低劑量組（20μmol/L）、中劑量組（40μmol/L）、高劑量組（80μmol/L）4組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細胞和細胞上

3、液，RT-PCR檢測miR-29a、miR-29b1、BACE1 mRNA表達水平， ELISA法檢測BACE1蛋白、Aβ1-42含量。
　　2.采用慢病毒感染實驗方法將外源性的miR-29a或miR-29b1轉入皮質神經元細胞，以建立高表達細胞模型。實驗分組分別為：空白對照組、單獨染鋁組（包括低劑量組（20μmol/L）、中劑量組（40μmol/L）、高劑量組（80μmol/L））、轉染陰性組、目的基因轉染組，目的基因轉染組完成

4、轉染后進行麥芽酚鋁染毒，分別為轉染陽性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集各組細胞和細胞上液，RT-PCR檢測BACE1 mRNA表達水平，ELISA法檢測BACE1蛋白、Aβ1-42含量。
　　3.培養(yǎng) HEK293細胞系，并采用脂質體轉染技術將外源性的 miR29a或miR-29b1轉染入細胞，建立高表達細胞模型。實驗分組分別為：空白對照組、單獨染鋁組（包括低劑量組（100μmol/L）、中劑量組（200

5、μmol/L）、高劑量組（400μmol/L））、轉染陰性組、目的基因轉染組，目的基因轉染組完成轉染后進行麥芽酚鋁染毒，分別為轉染陽性組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集各組細胞和細胞上液，RT-PCR檢測BACE1 mRNA表達水平，ELISA法檢測BACE1蛋白、Aβ1-42含量。
　　4.培養(yǎng)大鼠皮質神經元細胞，分別選擇NF-κB激動劑（TPA）和抑制劑（PDTC）對細胞進行干預實驗，實驗分組分別為：空白對

6、照組、NF-κB激動劑組（1μM）、NF-κB抑制劑組（50μM）、麥芽酚鋁染毒組（40μM）、麥芽酚鋁+NF-κB抑制劑組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集各組細胞和細胞上液，RT-PCR檢測miR-29a、miR-29b1、BACE1 mRNA表達水平，ELISA法檢測BACE1蛋白、Aβ1-42含量。
　　結果：
　　1.培養(yǎng)大鼠皮質神經元細胞并進行免疫組化實驗發(fā)現，神經元細胞純度達到95％。應用不同劑量麥芽酚鋁染毒原代神經元細胞

7、后，隨著染毒濃度的增加，BACE1 mRNA和BACE1蛋白表達量明顯增加，與對照組相比，中、高劑量組差異有統計學意義；Aβ1-42水平明顯增加，中、高劑量組差異有統計學意義；miR-29a和miR-29b1表達量不同程度下降，與對照組相比，低劑量組差異無統計學意義，中、高劑量組差異有統計學意義。
　　2.分別對大鼠皮質神經元細胞轉染miR-29a和miR-29b1后發(fā)現，與空白對照組相比，轉染陰性組BACE1 mRNA、BACE

8、1蛋白表達無明顯變化，轉染陽性組BACE1 mRNA、BACE1蛋白表達下降，但BACE1 mRNA下降無統計學意義，BACE1蛋白下降有統計學意義；與同等劑量單獨染鋁組相比，轉染后聯合麥芽酚鋁染毒組BACE1 mRNA、BACE1蛋白表達下降，低劑量組下降無統計學意義，中、高劑量組下降有統計學意義。與空白對照組相比，轉染陰性組Aβ1-42水平無明顯變化，轉染陽性組Aβ1-42水平降低，差異有統計學意義；與同等劑量單獨染鋁組相比，轉染后

9、聯合麥芽酚鋁染毒組Aβ1-42水平明顯降低，低劑量組差異無統計學意義，中、高劑量組差異有統計學意義。
　　3.采用脂質體轉染方法將外源性的miR-29a和miR-29b1分別轉染HEK293細胞36h后，經RT-PCR檢測發(fā)現miR-29a和miR-29b1的相對表達量分別達到427和480倍，轉染完成后麥芽酚鋁染毒24h。其結果顯示，與空白對照組相比，單獨染鋁組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達量明顯升高，轉

10、染陰性組BACE1mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達量無明顯變化，轉染miR-29a各組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達降低，但BACE1 mRNA降低無統計學意義，BACE1蛋白和Aβ1-42降低有統計學意義；轉染miR-29b1各組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達都降低；與同等劑量單獨染鋁組相比，轉染miR-29a或miR-29b1后聯合麥芽酚鋁染毒組BACE1 mRNA、BACE

11、1蛋白和Aβ1-42表達量都明顯降低，差異有統計學意義。
　　4.對皮質神經元細胞干預實驗后發(fā)現，與空白對照組相比，NF-κB激動劑組和單獨麥芽酚鋁染毒組miR-29a、miR-29b1表達下降；NF-κB抑制劑組miR-29a、miR-29b1表達升高，但miR29a升高有統計學意義，miR-29b1升高無統計學意義；與單獨麥芽酚鋁染毒組相比，麥芽酚鋁染毒聯合NF-κB抑制劑組miR-29a、miR-29b1表達升高。與空白對照

12、組相比， NF-κB激動劑組和單獨麥芽酚鋁染毒組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達量明顯升高；NF-κB抑制劑組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達量降低，但BACE1 mRNA降低無統計學意義，BACE1蛋白和Aβ1-42降低有統計學意義；與單獨麥芽酚鋁染毒組相比，麥芽酚鋁染毒聯合NF-κB抑制劑組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達量降低，差異有統計學意義。
　　結論：<