Sphk1在乳腺癌惡性轉化過程中作用的初步實驗研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學碩士學位論文Sphk1在乳腺癌惡性轉化過程中作用的初步實驗研究姓名：張彥申請學位級別：碩士專業(yè)：外科學(普外)指導教師：姜軍2012-11第三軍醫(yī)大學碩士學位論文殖、凋亡及遷移中的作用。通過上述研究以期初步探討S p h k l 在乳腺癌進展中的作用，為進一步揭示S p h k l 在惡性腫瘤中的生物學行為提供實驗依據(jù)，為惡性腫瘤的分子靶點的研發(fā)提供新的思路。研究方法和主要結果：1 ．S p h k l 在人正常乳腺上皮細胞

2、惡性轉化過程中的作用研究。方法：利用化學致癌劑( D M B A ，二甲基苯葸) 誘導正常的乳腺上皮細胞( M C F ．1 0 A ) ，在此過程中通過實時熒光定量P C R ( R e a l t i m eQ u a n t i t a t i v eR e v e r s e T r a ns c r i p t i o n - P o l y m e r a s eC h i nR e a c t i o n ，q R T -

3、 P C R ) 的方法檢測誘導后的乳腺上皮細胞的S p h k l m R N A 的表達情況，用C C K ．8 和流式細胞術檢測細胞增殖和凋亡能力的變化。軟瓊脂克隆形成實驗來檢測誘導后轉化細胞的惡性能力。結果：轉化后細胞形態(tài)發(fā)生了改變，表現(xiàn)為細胞排列緊密，交織在一起，細胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，胞核異型性，失去接觸抑制。細胞中的S p h k lm R N A 表達水平較未誘導的正常細胞明顯升高( 氏0 ．0 5 ) 。誘導后的細胞

4、的增殖能力明顯提高( P < 0 ．0 5 ) ，細胞凋亡比例降低( 尸< O ．0 5 ) 。D M B A 誘導后的第3 0 代細胞能在軟瓊脂上形成克?。粚φ战M細胞未能形成克隆。2 ．S p h k l 基因對人乳腺癌M C F ．7 細胞增殖、凋亡和遷移能力的影響。方法：小干擾R N A ( s i R N A ) 轉染M C F ．7 細胞，以沉默S p h k l 的表達。流式細胞術檢測轉染效率。q R T - P

5、 C R 、W e s t e r nb l o t t i n g ( W B ) 法檢測s i R N A 后，S p h k l 在人乳腺癌M C F ．7 細胞中的表達情況，篩選作用效果最明顯的s i R N A 序列及作用時間點。利用C C K ．8 、流式細胞術及t r a n s w e l l 法觀測干擾S p h k l 表達后對乳腺癌細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響。結果：S p h k ls i R N A 轉染效率

6、達8 9 ％。轉染s i R N A 后，M C F ．7 細胞的S p h k lm R N A和蛋白表達水平均明顯下降，以s i R N A ．2 效果最為顯著( 氏0 ．0 5 ) 。轉染S p h k ls i R N A ．2后，M C F 一7 細胞的增殖和遷移能力明顯下降，凋亡細胞比例增加，以上差異均具有統(tǒng)計學意義( P < O ．0 5 ) 。結 論S p h k l 在乳腺癌中發(fā)揮癌基因樣功能，在正常上皮細胞向癌