豬WNT4基因的克隆、生物信息學(xué)預(yù)測及組織表達(dá)譜分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、Wnt4(Wingless-related MMTV integration site4,無翅相關(guān)的小鼠乳房腫瘤病毒整合位點(diǎn)4)是Wnt家族重要的成員之一,Wnt蛋白是一種分泌型糖蛋白,通過自分泌或旁分泌作用,它們組成一個高度保守的信號分子家族.Wnt通路決定細(xì)胞的分化命運(yùn),在動物發(fā)育中起著廣泛的作用;而近來研究發(fā)現(xiàn),Wnt信號通路在生殖系統(tǒng)中也起著重要的作用,與生殖最相關(guān)的可能是非典型的Wnt/β-catenin信號通路。因此,對Wn

2、t4基因的克隆測序和初步分析,可以為研究豬的Wnt4基因的生物學(xué)功能和品種改良提供基礎(chǔ)的基因信息。
   本文采用電子克隆的方法,結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù),獲得了豬Wnt4基因的cDNA全序列。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,并進(jìn)行了同源序列多重比對和分子系統(tǒng)發(fā)生分析。利用實(shí)時熒光定量( Real-time)PCR技術(shù)分析了豬Wnt4基因的mRNA在不同組織的相對表達(dá)水平。
   1 Wnt4基因的克隆

3、測序
   用人的Wnt4基因的cDNA全序列作為電子探針,分別從NCBI的dbEST和UniGene數(shù)據(jù)庫釣取了共5條豬的EST序列,將其輸入DNAstar-SeqMan程序,最后拼接出2個重疊群(Contig)序列。在此基礎(chǔ)上,利用Oligo6.0軟件手動設(shè)計(jì)引物,借助RT-PCR和RACE技術(shù)一方面驗(yàn)證了電子克隆的正確性;另一方面擴(kuò)增出cDNA全序列,長度為3232bp, GenBank登錄號為FJ759131.
 

4、  2 Wnt4蛋白的生物信息學(xué)分析
   借助生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源和軟件,預(yù)測出豬Wnt4基因開放閱讀框的長度為1254bp,編碼417個氨基酸殘基,且兩側(cè)分別是260bp的5’UTR和1718bp的3’UTR。通過對蛋白序列相似性檢索,預(yù)測出豬Wnt4蛋白含有一個信號肽,為分泌性蛋白質(zhì);不合明顯的疏水區(qū);定位于細(xì)胞外。而且確定其含有Wnt4結(jié)構(gòu)域。推測豬Wnt4蛋白參與細(xì)胞的分化、發(fā)育和繁殖等過程。
   3 Rea

5、l-time PCR分析Wnt4基因的組織表達(dá)譜
   利用Real-time PCR技術(shù)對豬各組織的Wnt4基因的mRNA進(jìn)行定量分析,基因表達(dá)量使用2-△△CT法進(jìn)行處理,其中△△CT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因),處理結(jié)果使用SPSS16.0進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果表明:Wnt4基因在豬的不同組織中廣泛表達(dá),但Wnt4基因在體內(nèi)各組織中的表達(dá)豐度有差異,已證實(shí)該基因最初表達(dá)于腎小管間充質(zhì)及未分化的性腺中。但經(jīng)過性別特異的

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