豬WNT4基因的克隆、生物信息學(xué)預(yù)測及組織表達(dá)譜分析.pdf

1、Wnt4（Wingless-related MMTV integration site4，無翅相關(guān)的小鼠乳房腫瘤病毒整合位點(diǎn)4）是Wnt家族重要的成員之一，Wnt蛋白是一種分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌作用，它們組成一個高度保守的信號分子家族.Wnt通路決定細(xì)胞的分化命運(yùn)，在動物發(fā)育中起著廣泛的作用；而近來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在生殖系統(tǒng)中也起著重要的作用，與生殖最相關(guān)的可能是非典型的Wnt/β-catenin信號通路。因此，對Wn

2、t4基因的克隆測序和初步分析，可以為研究豬的Wnt4基因的生物學(xué)功能和品種改良提供基礎(chǔ)的基因信息。
　　 本文采用電子克隆的方法，結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得了豬Wnt4基因的cDNA全序列。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，并進(jìn)行了同源序列多重比對和分子系統(tǒng)發(fā)生分析。利用實(shí)時熒光定量( Real-time)PCR技術(shù)分析了豬Wnt4基因的mRNA在不同組織的相對表達(dá)水平。
　　 1 Wnt4基因的克隆

3、測序
　　 用人的Wnt4基因的cDNA全序列作為電子探針，分別從NCBI的dbEST和UniGene數(shù)據(jù)庫釣取了共5條豬的EST序列，將其輸入DNAstar-SeqMan程序，最后拼接出2個重疊群（Contig）序列。在此基礎(chǔ)上，利用Oligo6.0軟件手動設(shè)計(jì)引物，借助RT-PCR和RACE技術(shù)一方面驗(yàn)證了電子克隆的正確性；另一方面擴(kuò)增出cDNA全序列，長度為3232bp, GenBank登錄號為FJ759131.
　

4、　 2 Wnt4蛋白的生物信息學(xué)分析
　　 借助生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源和軟件，預(yù)測出豬Wnt4基因開放閱讀框的長度為1254bp，編碼417個氨基酸殘基，且兩側(cè)分別是260bp的5’UTR和1718bp的3’UTR。通過對蛋白序列相似性檢索，預(yù)測出豬Wnt4蛋白含有一個信號肽，為分泌性蛋白質(zhì)；不合明顯的疏水區(qū)；定位于細(xì)胞外。而且確定其含有Wnt4結(jié)構(gòu)域。推測豬Wnt4蛋白參與細(xì)胞的分化、發(fā)育和繁殖等過程。
　　 3 Rea

5、l-time PCR分析Wnt4基因的組織表達(dá)譜
　　 利用Real-time PCR技術(shù)對豬各組織的Wnt4基因的mRNA進(jìn)行定量分析，基因表達(dá)量使用2-△△CT法進(jìn)行處理，其中△△CT=（CT目的基因-CT內(nèi)參基因），處理結(jié)果使用SPSS16.0進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果表明：Wnt4基因在豬的不同組織中廣泛表達(dá)，但Wnt4基因在體內(nèi)各組織中的表達(dá)豐度有差異，已證實(shí)該基因最初表達(dá)于腎小管間充質(zhì)及未分化的性腺中。但經(jīng)過性別特異的