嗜鹽微生物分離鑒定及耐鹽運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌工程菌構(gòu)建.pdf

1、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）因具有突出的代謝能力而成為產(chǎn)燃料乙醇的優(yōu)良宿主菌之一，但是該菌對(duì)纖維素發(fā)酵水解液或生物柴油廢棄物中產(chǎn)生的鹽比較敏感（如 NaCl等），在以這些生物質(zhì)為原料的發(fā)酵過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)受到極大抑制，使乙醇產(chǎn)率大幅度下降。為獲得耐鹽表型改善的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，本研究從嗜鹽微生物菌株篩選出發(fā)，并嘗試將其耐鹽功能候選基因應(yīng)用在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，以獲得耐鹽運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌工程菌株。主要結(jié)論如下：
　

2、?。?）從煙臺(tái)渤海鹽泥沉積物，以高濃度NaCl作為篩選壓力，并通過(guò)一系列多相分類鑒定學(xué)方法，分離鑒定1株嗜鹽菌Lentibacillus屬新種，命名為L(zhǎng)entibacillus amyloliquefaciens，模式菌為L(zhǎng)AM0015T。該菌株的16S rDNA序列提交在NCBI，登錄號(hào)為KJ002449。該模式菌種分別保藏在中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心（ACCC06401）和日本菌種保藏中心（JCM19838）。
　?。?）完成

3、了L. amyloliquefaciens LAM0015T的全基因組測(cè)序（NCBI登錄號(hào)為CP013862），其基因組大小3,858,520 bp，G+C含量為42.12％，預(yù)測(cè)編碼基因共2496個(gè)， ncRNA基因共169個(gè)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，含有大量的天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘油、甜菜堿等滲透壓平衡相關(guān)的編碼基因，為進(jìn)一步揭示嗜鹽機(jī)制和發(fā)掘耐鹽等功能基因奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)為其他功能基因的應(yīng)用提供重要依據(jù)。
　?。?）從菌株L.

4、 amyloliquefaciens LAM0015T的基因組中分別克隆了甜菜堿和四氫嘧啶合成等耐鹽候選基因；同時(shí)構(gòu)建了該菌株的基因組克隆文庫(kù)，通過(guò)鹽脅迫篩選，獲得了若干潛在耐鹽功能基因，例如ABC運(yùn)輸體透性酶蛋白基因、TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因、青霉素結(jié)合蛋白基因等，經(jīng)驗(yàn)證這些基因?qū)λ拗鞔竽c桿菌的耐鹽表型有一定程度的改善。
　?。?）基于Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建Z. mobilis ZM4的隨機(jī)突變文庫(kù)，篩選獲得1株耐鹽表型改善的突

5、變菌株，命名為Z. mobilis ZMT2（保藏號(hào)CGMCC No.11888）。通過(guò)染色體步移的方法，確定突變株中轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)在ZMO1122（himA）中。目前沒有ZMO1122與鹽耐受性相關(guān)的報(bào)道，為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因與鹽耐受性的關(guān)系，利用基因敲除技術(shù)將野生型菌株的該基因敲除，獲得敲除菌株Z. mobilisΔ1122。
　?。?）發(fā)酵評(píng)估數(shù)據(jù)表明：突變菌株 ZMT2在鹽脅迫情況下具有較高的乙醇產(chǎn)率、較高的生長(zhǎng)速率及較快的

6、葡萄糖利用速率。低鹽（小于1.5% NaCl）培養(yǎng)時(shí)，突變株與野生株生長(zhǎng)無(wú)明顯差異。低糖1.5%NaCl脅迫發(fā)酵10 h，ZMT2幾乎將葡萄糖全部利用，而Δ1122和ZM4分別只利用了總葡萄糖的67.15%和69.70%，20 h后才利用完；高糖1.5%NaCl發(fā)酵40 h, ZMT2和Δ1122的OD600分別是ZM4的1.62倍和1.74倍，葡萄糖的利用分別是ZM4的1.46倍和1.54倍，乙醇產(chǎn)量是ZM4的2.21倍和2.35倍。

7、含2%NaCl低糖培養(yǎng)18 h時(shí)， ZMT2和Δ1122的OD600分別是ZM4的1.15倍和1.13倍，而高糖培養(yǎng)26 h時(shí)，分別是ZM4的1.17倍和1.13倍。
　?。?）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：ZMO1122在ZMT2和Δ1122中無(wú)論有無(wú)鹽脅迫下均無(wú)相對(duì)表達(dá)，表明該基因已被敲除，ZM4在低糖1.5% NaCl培養(yǎng)下的ZMO1122（3.18±0.88）的相對(duì)表達(dá)量是0%（0.56±0.17），1%（0.55±0.39