外周血淋巴細(xì)胞MHC-Ⅰ在急性移植排斥反應(yīng)中的變化規(guī)律.pdf

1、目的：1.建立檢測(cè)移植受者外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time PCR) 的方法；2.通過(guò)動(dòng)態(tài)連續(xù)檢測(cè)宿主PBLs MHC-I基因和蛋白水平的表達(dá)，揭示移植受者PBLs MHC-I在急性移植排斥反應(yīng)過(guò)程中的變化規(guī)律，探討其表達(dá)與同種異體移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生進(jìn)程的對(duì)應(yīng)關(guān)系；3. 通過(guò)檢測(cè)不同免疫抑制劑單一和/或聯(lián)合用藥情況下，宿主PBLs MHC-I/-Ⅱ mR

2、NA表達(dá)的變化，探索免疫抑制劑劑量與宿主PBLs MHC基因表達(dá)之間的關(guān)系；并分析MHC-I mRAN表達(dá)與環(huán)孢霉素A(CsA)血藥濃度之間的關(guān)系，探討移植受者外周血淋巴細(xì)胞MHC-I mRAN的表達(dá)能否作為評(píng)估機(jī)體免疫抑制程度的監(jiān)測(cè)參數(shù)，從而為指導(dǎo)臨床免疫抑制劑的個(gè)體化用藥提供依據(jù)；4. 通過(guò)與目前學(xué)術(shù)界己證實(shí)的移植排斥反應(yīng)的無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)(外周血淋巴細(xì)胞HLA-DR、FasL)進(jìn)行比較，探討Real Time PCR方法檢測(cè)移植受者外周

3、血淋巴細(xì)胞MHC-I mRNA表達(dá)作為監(jiān)測(cè)急性移植排斥反應(yīng)無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)的可行性，篩選診斷AR的敏感指標(biāo)。 方法：1.Real Time PCR檢測(cè)方法的建立。依據(jù)GenBank中小鼠MHC mRNA序列，根據(jù)MHC-I/-II基因外顯子4、5中的保守序列自主設(shè)計(jì)篩選引物；以管家基因β-actin作為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)引物。運(yùn)用SYBR Green I嵌合熒光Real Time PCR定量檢測(cè)技術(shù)擴(kuò)增MHC mRNA的表達(dá)；2.在第一部分

4、(外周血淋巴細(xì)胞MHC-I與急性排斥的研究)研究中，將225只SPF(Specific Pathogen Free，無(wú)特殊病原菌)級(jí)近交系C57BL/6小鼠(組織相容性基因： H-2b)和BALB/C小鼠(組織相容性基因： H-2d)隨機(jī)分為2組。對(duì)照組(n=30， 30只正常健康的BALB/C小鼠作為皮膚移植術(shù)前對(duì)照)；實(shí)驗(yàn)組(n=195，移植未用藥)：包括Ea組(n=65，同種異基因移植BALB/C組， H-2b to H-2d)，

5、Eb組(n=65，同種異基因移植C57BL/6組， H-2d to H-2b)和Ec組(n=65，同種同基因移植組， H-2d to H-2d)。其中各實(shí)驗(yàn)組根據(jù)采血時(shí)間不同又分為術(shù)后不同時(shí)間組，每組5只小鼠。采用經(jīng)典的小鼠皮膚移植排斥模型，標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行皮膚移植手術(shù)。對(duì)上述各組分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法連續(xù)檢測(cè)移植受者PBLs MHC-I(包括H-2K，H-2D)、MHC-II(包括H-2Ia，H-2Ie)和FasL mRNA表達(dá)水

6、平的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞MHC-I類抗原(H-2K)和MHC-II類抗原(H-2Ia)的表達(dá)，H-E常規(guī)病理切片連續(xù)監(jiān)測(cè)移植物發(fā)生排斥反應(yīng)的組織學(xué)改變，并記錄病理分級(jí)情況與排斥反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間。 3.在第二部分(免疫抑制劑劑量對(duì)外周血淋巴細(xì)胞MHC-I表達(dá)的影響)研究中，首先，本實(shí)驗(yàn)研究了不同劑量免疫抑制劑對(duì)非移植手術(shù)小鼠PBLs MHC基因表達(dá)的影響。將90只SPF級(jí)近交系BALB/C小鼠隨機(jī)分為4組。對(duì)照組(n=20，包

7、括10只正常健康的BALB/C小鼠作為用藥前對(duì)照組和10只給予安慰劑處理的小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組)和實(shí)驗(yàn)組(n=70，包括環(huán)孢素A(CsA)單一用藥組，強(qiáng)的松(Pred)單一用藥組，CsA和強(qiáng)的松聯(lián)合用藥組)；同時(shí)以上各實(shí)驗(yàn)組又包括不同劑量組：10mg/kg/day，20 mg/kg/day，40 mg/kg/day，60mg/kg/day，80 mg/kg/day，每組5只小鼠。對(duì)上述各組分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)用藥的非移植小鼠

8、PBLs MHC-I(H-2K，H-2D)和MHC-II(H-2Ia，H-2Ie)mRNA表達(dá)水平的變化，探索可引起宿主PBLs MHC-I基因表達(dá)下降的免疫抑制劑劑量，熒光偏振免疫分析法(FPIA)檢測(cè)不同劑量CsA血藥濃度的變化；其次，本實(shí)驗(yàn)還研究了不同劑量免疫抑制劑對(duì)移植手術(shù)小鼠PBLs MHC基因表達(dá)的影響。將285只SPF級(jí)近交系C57BL/6小鼠(組織相容性基因： H-2b)和BALB/C小鼠(組織相容性基因： H-2d)隨

9、機(jī)分為2組：對(duì)照組(n=30，30只正常健康不用藥的BALB/C小鼠作為移植術(shù)前對(duì)照)和實(shí)驗(yàn)組。其中，實(shí)驗(yàn)組(n=255，移植用藥組)包括：Ea組(n=85，同種異基因移植小劑量用藥組，H-2b to H-2d，CsA 30mg/kg+Pred 30mg/kg)、Eb組(n=85，同種異基因移植大劑量用藥組，H-2b to H-2d，CsA 60mg/kg+Pred 60mg/kg)和Ec組(n=85，同種同基因移植用藥組，H-2d t

10、o H-2d， CsA 30mg/kg+Pred30mg/kg)。其中各實(shí)驗(yàn)組根據(jù)采血時(shí)間不同又分為術(shù)后不同時(shí)間組，每組5只小鼠。 結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)小鼠一般情況和移植物肉眼觀察以及組織病理學(xué)改變?nèi)看婊畹膶?shí)驗(yàn)小鼠一般狀況良好，體重略有增加。同種同基因(同系)移植小鼠呈現(xiàn)移植耐受狀態(tài)，無(wú)排斥現(xiàn)象發(fā)生，移植物的大體觀察及組織病理學(xué)檢查與移植前相比均無(wú)明顯改變。與同系移植組不同，同種異基因(異系)移植小鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重的排斥反應(yīng)。當(dāng)皮膚移植

11、物變黑、變硬，邊緣翹起，出現(xiàn)組織壞死，皮片面積縮小至原來(lái)的60％以上時(shí)，定為完全排斥。肉眼觀察移植未用藥BALB/C品系和C57BL/6品系組小鼠發(fā)生完全排斥的時(shí)間均為術(shù)后第11天左右，皮膚移植物平均存活時(shí)間(MST)為8.20±1.04，而移植用藥小劑量組小鼠皮膚移植物發(fā)生完全排斥的時(shí)間為移植術(shù)后第18天左右，移植物MST為17.05±1.17，移植用藥大劑量組小鼠皮膚移植物發(fā)生完全排斥的時(shí)間是移植術(shù)后第25天左右，移植物MST為25

12、.08±1.11，與移植未用藥小鼠相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；2. 移植受者PBLs MHC mRNA表達(dá)在急性移植排斥反應(yīng)過(guò)程中的變化規(guī)律；3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，異系移植未用藥組小鼠CD8+T細(xì)胞H-2K、H-2Ia抗原平均熒光強(qiáng)度(MFI)與術(shù)前對(duì)照組相比呈升高表達(dá)趨勢(shì)，但差異不明顯；4. 對(duì)PBLs MHC-Ⅰ mRNA表達(dá)與其他公認(rèn)的移植排斥反應(yīng)的無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：與同系移植(未用

13、藥和用藥)非排斥組相比，異系移植(未用藥和小劑量用藥)排斥組小鼠PBLs H-2Ie(相當(dāng)于人類HLA-DR))mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)分別出現(xiàn)于移植術(shù)后第11天和第15天。同樣，PBLs FasLmRNA表達(dá)排斥組較非排斥組也明顯升高(P＜0.05)，分別出現(xiàn)于移植術(shù)后第9-13天和第15天左右，對(duì)應(yīng)排斥病理分級(jí)的Ⅲ-Ⅳ級(jí)；5.不同劑量免疫抑制劑對(duì)非移植手術(shù)小鼠PBLs MHC基因表達(dá)影響的結(jié)果；6.不同劑量免疫抑制劑對(duì)移

14、植手術(shù)小鼠PBLs MHC-I mRNA表達(dá)影響的結(jié)果。當(dāng)排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，與對(duì)照組相比，小劑量和大劑量CsA和強(qiáng)的松聯(lián)合用藥異系移植組小鼠PBLs MHC-I mRNA表達(dá)均升高，但大劑量組PBLs MHC-I mRNA升高表達(dá)出現(xiàn)的時(shí)間明顯晚于小劑量組，而且升高的幅度也比小劑量組低。 結(jié)論：1.Real Time PCR方法連續(xù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)移植受者外周血淋巴細(xì)胞MHC-I(尤其H-2K基因位點(diǎn))mRNA表達(dá)有助于早期發(fā)現(xiàn)急性移植排