Kupffer細(xì)胞調(diào)控Th17細(xì)胞分化及其在大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、目的：急性排斥反應(yīng)是肝臟移植術(shù)后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是導(dǎo)致慢性排斥和移植物失功的重要原因之一，研究肝臟移植后免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制有助于為急性排斥反應(yīng)提供新的治療手段。輔助性T細(xì)胞17(Thelper17 cells，Th17)以表達(dá)IL-17而得名，是不同于Th1、Th2的CD4+T細(xì)胞新亞群，在自身免疫性疾病、機(jī)體抗感染、腫瘤發(fā)生和器官移植排斥中發(fā)揮重要作用。業(yè)已證明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforminggrowth factor b

2、eta，TGF-β)與IL-6聯(lián)合作用能誘導(dǎo)原始CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞。而Kupffer細(xì)胞作為體內(nèi)最大的定居型巨噬細(xì)胞群，在活化狀態(tài)下既可吞噬腸道來(lái)源的病原菌以及內(nèi)毒素，又可釋放大量生物活性物質(zhì)，具有強(qiáng)大的抗原遞呈功能，為淋巴細(xì)胞的分化、增殖、成熟以及凋亡等提供各種調(diào)節(jié)信號(hào)。鑒于肝臟中Kupffer細(xì)胞在病理生理?xiàng)l件下分泌大量TGF-β與IL-6等細(xì)胞因子，我們認(rèn)為此時(shí)形成的肝臟局部免疫微環(huán)境有利于Th17細(xì)胞的分化和增殖，

3、而Th17細(xì)胞可能在肝臟免疫性疾病及排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。我們通過建立大鼠肝臟移植急性排斥模型，探討Th17細(xì)胞在肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用及機(jī)制，同時(shí)利用氯化釓(gadolinium trichloride，GdCl3)抑制Kupffer細(xì)胞功能，觀察其對(duì)移植排斥反應(yīng)的作用及Th17細(xì)胞的影響，并通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Kupffer細(xì)胞對(duì)Th17細(xì)胞分化的調(diào)控作用。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用近交系雄性Dark Agouti(

4、DA)和Brown Norway(BN)大鼠，體重200～300g，改良Kamada法建立大鼠原位肝臟移植模型。實(shí)驗(yàn)分組：(A)異基因組：DA大鼠作為供體，BN大鼠作為受體；(B)GdCl3預(yù)處理組：DA大鼠作為供體，BN大鼠作為受體，供體術(shù)前24小時(shí)陰莖靜脈注射GdCl3(10 mg/kg)；(C)同基因組：供受體均采用BN大鼠。每組各18對(duì)，6只觀察生存期，其余于術(shù)后5天和10天處死，留取外周血和肝組織標(biāo)本，分別檢測(cè)肝功能、肝臟病理

5、組織學(xué)分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血和肝臟淋巴細(xì)胞Th17細(xì)胞比例，使用熒光定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)、免疫組化以及酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)肝組織IL-17、IL-6、TGF-β mRNA和蛋白表達(dá)水平。在體外將通過原位膠原酶灌注結(jié)合離心淘洗法分離的大鼠Kupffer細(xì)胞與

6、使用免疫磁珠法分選出的脾臟初始CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，然后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析其淋巴細(xì)胞表型。
　　 結(jié)果：與同基因移植大鼠比較，異基因移植大鼠出現(xiàn)典型急性排斥反應(yīng)改變，肝臟Kupffer細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，其中Th17細(xì)胞比例增高，同時(shí)肝內(nèi)IL-8、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、TGF-β和IL-6表達(dá)水平明顯上升。注射氯化釓的大鼠肝臟Kupffer細(xì)胞數(shù)量明顯下降，急性排斥反應(yīng)明顯改善，生存

7、時(shí)間延長(zhǎng)，并且肝內(nèi)與外周血Th17水平顯著降低，同時(shí)肝內(nèi)TGF-β和IL-6表達(dá)下降。可見氯化釓能夠有效地抑制Kupffer細(xì)胞的免疫活性和Th17細(xì)胞增殖，從而抑制大鼠同種異基因肝移植后急性排斥反應(yīng)。分別分離急性排斥大鼠和同基因移植大鼠肝臟Kupffer細(xì)胞，與正常DA大鼠脾臟原始CD4+T細(xì)胞混合培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)前者Th17細(xì)胞比例也明顯高于后者(30.8％vs8.1％)，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)急性排斥大鼠Kupffer細(xì)胞培養(yǎng)