單核-巨噬細胞SIRT1失活加重糖尿病小鼠梗死心臟功能障礙的實驗研究.pdf

1、第一部分糖尿病致小鼠單核/巨噬細胞SIRT1失活和對致炎物質(zhì)敏感性增強
　　目的：本實驗通過整體、細胞、分子水平不同層次研究正常、高糖、高糖給予白藜蘆醇(Res)環(huán)境下沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的變化與外周血單核細胞炎癥功能的改變及對糖尿病心功能改善情況的影響。
　　方法：
　　1.體內(nèi)試驗：SPF級C57BL/6小鼠隨機分為3組，正常對照組(Con組)，糖尿病組(DM組)，糖尿病給予白藜蘆醇組(DM+Res組)

2、。糖尿病成模后8周，用小動物超聲法測3組小鼠心臟舒張功能的變化；取各組小鼠外周血單核巨噬細胞用流式細胞技術(shù)測SIRT1的表達；取各組心臟石蠟組織切片進行SIRT1、CCR2（趨化因子2受體）及炎癥因子的免疫組織化學(xué)染色，Western blot檢測 SIRT1、CCR2、CX3CR1的蛋白表達，雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定觀察高糖誘導(dǎo)外周血單核巨噬細胞及心臟的組織炎癥反應(yīng)變化。
　　2.體外試驗：以培養(yǎng)巨噬細胞系RAW2

3、64.7細胞株為實驗?zāi)Ｐ?；?yīng)用不同濃度終末糖基化產(chǎn)物（AGEs）刺激RAW264.7細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)， ELISA法測定炎癥因子IL-1β，TNF-α；用Western blot檢測SIRT1、CCR2及Acetyl-NFκB的蛋白水平；應(yīng)用AGEs刺激RAW264.7細胞制備成高糖模型，觀察 Res及 Ex527對高糖炎癥的影響，同時應(yīng)用熒免疫熒光及 Western blot法檢測SIRT1、Acetyl-NFκBp65及炎癥因子的表

4、達及用Transwell小室檢測RAW264.7細胞的遷移能力。
　　結(jié)果：
　　1.與Con組小鼠相比，DM組小鼠血糖隨著時間的推移顯著上升，體重顯著下降，心肌細胞排列紊亂、疏松，橫紋肌逐漸消失，心臟舒張功能發(fā)生障礙；給予SIRT1激動劑Res后DM小鼠心肌細胞排列得到改善，心肌細胞丟失減少，舒張功能改善。
　　2. DM組小鼠外周血單核/巨噬細胞和心肌組織SIRT1表達水平顯著降低，而心肌組織CCR2的表達明顯增加

5、，外周血單核/巨噬細胞M1型ly-6chigh與M2型ly-6clow的比值增加，CCR2/CX3CR1比值也明顯增加，細胞向炎癥表型偏移；給予 SIRT1激動劑Res后SIRT1表達水平比DM組明顯增加，而心肌組織CCR2的表達明顯減少，外周血單核/巨噬細胞M1型ly-6chigh與M2型ly-6clow的比值降低，CCR2/CX3CR1比值也明顯降低，細胞向抗炎表型偏移。
　　3.各組小鼠外周血單核/巨噬細胞炎癥因子IL-1β

6、及TNF-α水平變化無統(tǒng)計學(xué)意義；當體外給予生理濃度的Hydr（氫化可的松）預(yù)處理，再給予促炎劑LPS（脂多糖）刺激細胞，各組炎癥因子 IL-1β及TNF-α水平明顯增加；DM組較正常組小鼠炎癥因子 IL-1β及TNF-α水平顯著增加，而給予SIRT1激動劑Res治療組相對于DM組小鼠炎癥因子明顯降低。
　　4. AGEs體外處理劑量依賴性抑制RAW264.7細胞SIRT1蛋白表達的同時，刺激CCR2、Acetyl-NFκBp65

7、、IL-1β及TNF-α蛋白水平的表達，NF-κBp65乙?；鰪姡珻CR2/CX3CR1比值增加，細胞向促炎表型偏移，炎癥因子IL-1β及TNF-α分泌增多，細胞遷移、趨化能力增強。SIRT1激動劑 Res可以逆轉(zhuǎn) AGEs的作用，下調(diào)Acetyl-NFκBp65蛋白的表達，降低CCR2/CX3CR1比值，降低炎癥因子的產(chǎn)生，細胞遷移、趨化能力顯著降低，與 AGEs組比較差異具有顯著性；而抑制SIRT1通路作用則相反。
　　小結(jié)

8、：
　　1.體內(nèi)實驗表明糖尿病抑制SIRT1蛋白的表達，誘導(dǎo)外周血單核/巨噬細胞向炎癥表型偏移，促進糖尿病心肌組織炎癥反應(yīng)及心臟舒張功能障礙；白藜蘆醇激活SIRT1使外周血單核/巨噬細胞向抗炎表型偏移，改善糖尿病心肌病變和心臟舒張功能。
　　2.體外實驗表明AGEs降低RAW264.7細胞SIRT1蛋白的表達，CCR2/CX3CR1比值增加細胞，細胞向促炎表型偏移，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子，細胞遷移和趨化能力增強；Res激活SIRT

9、1使NF-κBp65去乙?；档虲CR2/CX3CR1比值，抑制RAW264.7細胞遷移和趨化，從而抑制RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)。
　　第二部分單核/巨噬細胞SIRT1失活加重糖尿病小鼠梗死心臟的炎癥反應(yīng)和功能障礙
　　目的：探討通過激活 SIRT1調(diào)控糖尿病心肌梗死急性期單核巨噬細胞表型，觀察對糖尿病心肌梗死心肌重塑及遠期心臟功能的影響及作用機制。
　　方法：用正常小鼠心肌梗死模型和1型糖尿病小鼠合并急性心肌梗

10、死模型進行實驗。心肌梗死手術(shù)統(tǒng)一在糖尿病第5周進行。糖尿病成模至心肌梗死手術(shù)后2周持續(xù)對DMI+Res組給予Res灌胃治療。用高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)檢測小鼠心臟收縮和舒張功能；Masson三色染色法檢測心肌纖維化情況；免疫組化方法檢測炎癥因子和毛細血管密度；取各組小鼠外周血單核巨噬細胞用流式細胞技術(shù)測 ly-6c、SIRT1的表達，用 ELISA法檢測炎癥因子 IL-1β，TNF-α的表達；Western blot方法檢測SIRT1

11、、CCR2和Acetyl-NFκB的蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1. LAD（冠狀動脈左前降支）結(jié)扎后小鼠心功能明顯受損，左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）和舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）比正常小鼠顯著增加，左心室射血分數(shù)（EF）和短軸縮短率（FS）顯著降低，左心室壁變??；小鼠心臟體重比明顯增加；梗死周邊區(qū)心肌細胞排列紊亂，心肌細胞減少，成纖維細胞大量增生，心肌梗死區(qū)嚴重纖維化。
　　2.與正常急性心肌梗死（AMI）組相

12、比，糖尿病急性心肌梗死（DMI）組小鼠外周血單核細胞SIRT1表達明顯減少，ly-6chigh/ly-6clow及CCR2/CX3CR1比值升高， Acetyl-NFκBp65、IL-1β和TNF-α表達增加，給予SIRT1激動劑Res治療后，DMI組小鼠外周血單核細胞 SIRT1表達明顯升高，而 ly-6chigh/ly-6clow及 CCR2/CX3CR1比值降低，Acetyl-NFκBp65、IL-1β和TNF-α表達降低。

13、>　　3.與AMI組相比，DMI組小鼠左心室心肌梗死面積增大、心肌纖維化程度明顯加重，心臟血管密度降低；與此同時，DMI組小鼠LVIDs、LVIDd明顯增加，EF、FS明顯降低，給予SIRT1激動劑Res治療后，DMI組小鼠左心室心肌梗死面積、心肌纖維化程度改善，心臟血管密度增加，LVIDs、LVIDd明顯降低，EF、FS明顯升高。
　　小結(jié)：
　　1.與AMI組相比，I型糖尿病小鼠心肌梗死急性期外周血單核/巨噬細胞SIRT

14、1通路受損，細胞向炎癥表型偏移增多，心肌急性期炎癥反應(yīng)增強，并伴隨心肌梗死遠期心肌纖維化進一步增加，心肌組織毛細血管密度進一步降低，心臟收縮功能障礙進一步加重。
　　2. SIRT1激動劑Res能改善I型糖尿病小鼠心肌梗死急性期單核/巨噬細胞向炎癥表型偏移，顯著降低心肌炎癥水平，同時增加1型糖尿病小鼠心肌梗死恢復(fù)期心肌組織毛細血管密度，減少梗死面積，減輕心肌纖維化，并改善梗死后的心肌收縮功能。
　　全文結(jié)論：
　　1.

15、 SIRT1通路受損誘導(dǎo)糖尿病心肌梗死急性期單核/巨噬細胞向炎癥表型偏移，炎癥水平增加，恢復(fù)期心肌組織毛細血管密度降低，心肌梗死面積、心肌纖維化增加，心功能障礙加重。
　　2. SIRT1通路激動劑Res能改善糖尿病誘導(dǎo)的外周血單核/巨噬細胞向炎癥表型偏移，抑制心血管炎癥，從而減少恢復(fù)期心肌梗死面積，減輕心肌纖維化程度，促進血管新生，改善糖尿病心臟舒張功能。
　　3. AGEs體外處理降低RAW264.7細胞SIRT1蛋白的