氟中毒腎損傷時STC1、UCP2的表達(dá)與作用及高鈣干預(yù)對其影響的機制研究.pdf

1、長時間、過量的氟攝入會導(dǎo)致機體組織和臟器的損傷，并特征性的引起氟斑牙、骨關(guān)節(jié)畸形、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)硬化。該類疾病均由氟中毒導(dǎo)致，并統(tǒng)稱為地氟病。地氟病是一種覆蓋各大洲，影響數(shù)千萬人的地球化學(xué)性疾病。近15年來，氟中毒對非骨相系統(tǒng)的影響正逐漸成為學(xué)界的研究熱點，其中又因為腎臟是機體排氟的最主要臟器和其本身就是氟中毒的靶器官，而使腎臟成為了非骨相系統(tǒng)研究中的重點。線粒體是氟離子攻擊細(xì)胞的核心靶點，腎臟作為富含線粒體的臟器，已在前人的大量研究

2、中證實了氟中毒能使腎小管上皮細(xì)胞中線粒體的結(jié)構(gòu)，功能活性受到嚴(yán)重影響，并與染氟劑量存在劑量-程度相關(guān)性，但是，氟中毒影響腎小管上皮細(xì)胞線粒體的毒理機制尚不明確，因此，本課題選擇從線粒體層面對氟中毒腎損傷進行相關(guān)機制的研究。
　　斯鈣素蛋白1(Stanniocalcm1，STC1)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣離子平衡的糖蛋白激素，在人體的許多臟器都有表達(dá)，高表達(dá)于腎臟、前列腺、子宮和甲狀腺。STC1主要通過自分泌和旁分泌起作用，并作用于細(xì)胞的線

3、粒體，調(diào)節(jié)鈣及磷酸鹽的代謝。近年來STC1的其他功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究顯示，STC1與損傷修復(fù)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管再生、類固醇生成、肌肉和骨的生長、腫瘤等相關(guān)。最新的研究顯示，STC1可以通過調(diào)節(jié)鈣離子的含量致使細(xì)胞第二信使功能減弱，并通過增高解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的表達(dá)來抑制線粒體膜電位降低和減少超氧化物的產(chǎn)量，這與細(xì)胞ATP的生成、NADH和FADH2平衡、ROS產(chǎn)量等息息相關(guān)。UCP2定位于線粒體內(nèi)膜，是一種調(diào)控線粒體內(nèi)外膜電

4、化學(xué)梯度的解偶聯(lián)蛋白，占線粒體膜蛋白含量的0.01-0.1％，在正常情況下，UCP2并沒有介導(dǎo)線粒體膜質(zhì)子漏，亦未對線粒體內(nèi)外膜的電位差產(chǎn)生過多影響。但在細(xì)胞受到攻擊或刺激時，特別是對能帶來氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化損傷的刺激，可促使UCP2介導(dǎo)線粒體內(nèi)外膜間發(fā)生質(zhì)子漏，從而降低線粒體內(nèi)外膜的膜電位差，使ROS產(chǎn)量減少、超氧化物產(chǎn)量減少等，并以之拮抗相關(guān)損傷給細(xì)胞、組織帶來的損害。UCP2介導(dǎo)線粒體膜電位差改變要借助于[Ca2+]及[Ca2+

5、]相關(guān)通道蛋白才能完成，且細(xì)胞鈣含量的改變也能促使UCP2的表達(dá)發(fā)生改變，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子與UCP2的關(guān)系不僅在機體抵御外界刺激時才能發(fā)生，而且在各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，UCP2可以作為一種腫瘤標(biāo)志物，通過調(diào)節(jié)鈣離子含量及鈣離子相關(guān)通道影響腫瘤細(xì)胞的各種異質(zhì)化功能。
　　本課題從線粒體層面對氟中毒腎損傷的分子機制進行研究，緊扣目前氟中毒腎損傷研究的薄弱點；以腎小管上皮細(xì)胞線粒體解偶聯(lián)蛋白2和斯鈣素蛋白1作為研究對象，以

6、鈣離子作為干擾條件，探討氟中毒腎損傷時UCP2、STC1是否參與了氟中毒腎損傷過程，是否在參與過程中受到鈣離子的影響，初步研究UCP2、STC1在氟中毒腎損傷機制中的作用；本研究先進行動物實驗，觀察氟中毒大鼠腎臟中UCP2、STC1的改變，線粒體解偶聯(lián)功能的改變和氧化應(yīng)激指標(biāo)的改變，以及這些改變與腎組織中[Ca2+]含量的關(guān)系，再給予大鼠高鈣飲食，觀察UCP2、STC1表達(dá)出現(xiàn)的變化，高鈣與該變化的關(guān)系；構(gòu)建重組UCP2真核表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒

7、，使腎小管上皮細(xì)胞(HK2)高表達(dá)UCP2，再以氯化鈣侵染細(xì)胞培養(yǎng)基，研究不同劑量氟化鈉干擾高表達(dá)UCP2的腎小管上皮細(xì)胞時，細(xì)胞生長情況、線粒體解偶聯(lián)相關(guān)指標(biāo)的變化，此類變化被高鈣環(huán)境干預(yù)后出現(xiàn)的改變，以及UCP2、STC1、[Ca2+]在氟中毒腎損傷中的關(guān)系；該實驗從亞細(xì)胞器水平對氟中毒腎損傷機制進行研究，選擇了與[Ca2+]、氧化應(yīng)激密切相關(guān)的UCP2、STC1作為研究靶點，實驗設(shè)計符合邏輯，該實驗的結(jié)果可為以后從線粒體水平研究氟

8、中毒腎損傷的分子機制提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　第一部分，氟中毒大鼠腎臟STC1、UCP2的表達(dá)及腎細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]含量的變化
　　目的：構(gòu)建符合實驗需要的氟中毒模型，檢測UCP2、STC1及鈣、磷離子在氟中毒大鼠腎損傷中的變化，探討UCP2、STC1在氟中毒腎損傷機制中的作用及與鈣離子的關(guān)系。
　　方法：24只雄性SD大鼠按體重平均分為4組：對照組、低氟組、中氟組、高氟組；對照組采用生理鹽水注射，實驗組按體重比分別給

9、予5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的NAF腹腔注射，每48小時注射1次，蒸餾水及常規(guī)鼠餌自由飼食；建模16周后，取左腎包埋固定，行免疫組化檢測UCP2、STC1的蛋白定位及表達(dá)，右腎組織50mg提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)分析UCP2、STC1基因表達(dá)水平，并熒光探針檢測腎細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平。
　　結(jié)果：免疫組化提示UCP2高表達(dá)于腎臟皮髓交界的近曲小管，STC1也主要定位于近曲小管，但有少量表達(dá)與髓質(zhì)的遠(yuǎn)

10、曲小管。免疫組化及RT-PCR結(jié)果提示三種染氟大鼠的UCP2、STC1表達(dá)量均顯著高于對照組，并隨著染氟劑量的增大而顯著增高(兩兩比較，P<0.05)；各實驗組大鼠腎細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量顯著高于對照組，且隨著染氟劑量的增大而增高(兩兩比較，P<0.05)；
　　結(jié)論：氟中毒大鼠腎損傷中，UCP2、STC1可能參與了損傷機制，而該損傷機制可能是由于鈣磷離子代謝失衡造成。
　　第二部分，高鈣干預(yù)下氟中毒大鼠腎臟STC1、UCP2的表

11、達(dá)及腎細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]含量的變化
　　目的：觀察UCP2、STC1在氟中毒大鼠腎臟中的變化，及高鈣對氟中毒的拮抗作用。探討UCP2、STC1與高鈣的相互聯(lián)系及在氟中毒腎損傷中的作用。
　　方法：42只雄性SD大鼠按體重分為對照組、低氟加鈣組、中氟加鈣組、高氟加鈣組；對照組采用生理鹽水注射，低、中、高氟加鈣組同樣按體重比分別給予5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的氟化鈉腹腔注射，每48小時注射1次，給予高鈣飲食。建

12、模16周后行免疫組化及RT-PCR檢測UCP2、STC1的定位及表達(dá)，熒光探針檢測腎細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平，并檢測腎組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的活性。
　　結(jié)果：印證了第一節(jié)中UCP2、STC1主要定位于腎臟皮髓交界的近曲小管，很少量表達(dá)于腎髓質(zhì)的遠(yuǎn)曲小管；與對照組相比較，UCP2、STC1在各染氟加鈣組的的表達(dá)隨著染氟濃度的增加而增高，差異有顯著性(P<0.05)。橫向?qū)Ρ韧瑒┝繂渭內(nèi)痉M，UCP2在高氟加鈣組的表達(dá)顯著高于高氟組(P

13、<0.05)，UCP2在低、中氟加鈣組對比低、中染氟組雖未出現(xiàn)顯著性改變，但在表達(dá)上也呈現(xiàn)上升的趨勢。STC1在各個染氟加鈣組的表達(dá)與對應(yīng)劑量的單純?nèi)痉M均未出現(xiàn)顯著性改變(P>0.05)，但在表達(dá)上也呈現(xiàn)上升的趨勢；各實驗組大鼠腎細(xì)胞[Ca2+]i水平顯著高于對照組，且隨著染氟劑量的增大而升高，高鈣可抑制腎細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平。
　　結(jié)論：氟中毒腎損傷時UCP2、STC1可反應(yīng)性增高，高鈣能拮抗氟中毒腎損傷作用，并促進UCP

14、2、STC1的表達(dá)，且抑制腎細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]水平。UCP2、STC1可能參與了氟中毒大鼠腎損傷機制，且具體的參與過程可能與鈣離子相關(guān)。
　　第三部分，氟中毒大鼠腎臟線粒體解偶聯(lián)相關(guān)指標(biāo)及氧自由基的變化
　　目的：檢測染氟大鼠腎組織中線粒體解偶聯(lián)相關(guān)指標(biāo)及氧自由基的變化，并與UCP2的表達(dá)進行比較，觀察UCP2的解偶聯(lián)功能是否參與了氟中毒腎損傷機制。
　　方法：提取大鼠腎臟線粒體，檢測線粒體呼吸功能；利用線粒體膜孔道開

15、放可以使線粒體發(fā)生腫脹的原理，使用熒光分光光度計檢測線粒體腫脹程度；利用羅丹明123可以在線粒體中迅速發(fā)生熒光淬滅的原理，使用熒光分光光度計檢測檢測氟中毒大鼠腎臟中線粒體的膜電位(△ψm)；利用來源于線粒體的未成對電子與氧結(jié)合生成的超氧陰離子可與四唑鹽(NBT)反應(yīng)，其生成物可以在激發(fā)波長為570nm時產(chǎn)生特征性吸收的原理，使用酶標(biāo)儀檢測線粒體超氧化物含量。
　　結(jié)果：與對照組相比，線粒體Ⅲ態(tài)呼吸率在低氟組出現(xiàn)了輕度回升，在中氟組

16、又趨于下降，但在低、中氟組未見顯著性差異(P>0.05)；在高氟組出現(xiàn)了顯著性降低(P<0.05)：與對照組相比，Ⅲ態(tài)呼吸率在低氟加鈣組出現(xiàn)了下降、在中氟加鈣組亦出現(xiàn)下降，但差異均無顯著性(P>0.05)，在高氟加鈣組能在一定程度上提升呼吸率。Ⅳ態(tài)呼吸率在低、中染氟組出現(xiàn)了升高，在高氟組出現(xiàn)了降低，差異均無顯著性(P>0.05)。鈣對氟中毒大鼠腎臟中線粒體的Ⅳ態(tài)呼吸率產(chǎn)生一定程度的抑制作用，但差異不明顯。線粒體呼吸控制率(RCR)隨著染

17、氟濃度的增高而逐漸減低，在高氟組出現(xiàn)了明顯降低(P<0.05)，鈣可以拮抗這種變化，雖在高氟加鈣組仍然呈現(xiàn)顯著性降低，但RCR數(shù)據(jù)出現(xiàn)了回升，在各染氟加鈣組均出現(xiàn)了線粒體呼吸控制率的改善。
　　結(jié)論：氟中毒腎損傷時，線粒體解偶聯(lián)相關(guān)指標(biāo)線粒體膜電位、線粒體腫脹所反映的線粒體膜通道轉(zhuǎn)運孔開放程度會發(fā)生顯著性改變，提示解偶聯(lián)功能可能參與到氟中毒腎損傷機制中；隨著染氟濃度的增高，線粒體腫脹程度和氧自由基水平都會提高，高鈣可以抑制以上的變

18、化，實驗結(jié)果印證了前人研究的氟中毒會造成線粒體損傷和氟中毒氧自由基損傷的機制，且高鈣能拮抗氟中毒損傷的作用。
　　第四部分，高表達(dá)UCP2的氟中毒腎小管上皮細(xì)胞與STC1、線粒體解偶聯(lián)功能的關(guān)系
　　目的：檢測氟化鈉對腎小管上皮細(xì)胞(HK2)生長的抑制作用，并檢測UCP2、STC1、線粒體解偶聯(lián)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，觀察在細(xì)胞層面UCP2、STC1、線粒體解偶聯(lián)相關(guān)指標(biāo)是否也出現(xiàn)了改變，及相互之間的關(guān)系如何。通過使腎小管上皮細(xì)胞高

19、表達(dá)UCP2，觀察UCP2對氟中毒造成的腎小管上皮細(xì)胞(HK2)的損傷是否存在拮抗作用，并同樣檢測STC1的表達(dá)，線粒體解偶聯(lián)相關(guān)指標(biāo)的變化和細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，觀測指標(biāo)的變化，探討UCP2、STC1、鈣離子與氟中毒腎損傷的關(guān)系。
　　方法：構(gòu)建含人UCP2基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HK2，給予正常的HK2和轉(zhuǎn)染了UCP2的HK2培養(yǎng)基中侵染低(0.8mmol/L)、中(1.6mmol/L)、高(2.4mmol/L)三個劑量的氟

20、化鈉，并使用氯化鈣調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的鈣濃度，通過MTT實驗檢測細(xì)胞的增殖情況；通過RT-PCR的方法檢測STC1的表達(dá)；提取細(xì)胞線粒體，檢測線粒體腫脹程度、線粒體的膜電位和細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量。
　　結(jié)果：腎小管上皮細(xì)胞的增殖活性隨著染氟程度的增加而增大，并且在中氟組、高氟組出現(xiàn)了顯著性降低(P<0.05)，高鈣可以拮抗氟中毒對腎小管上皮細(xì)胞的增殖抑制作用；高表達(dá)UCP2的腎小管上皮細(xì)胞在染氟環(huán)境下其增殖活性變化不一，在低氟組和中氟組，轉(zhuǎn)

21、染了UCP2的HK2可以在一定程度上拮抗氟中毒給細(xì)胞造成的增殖抑制，雖未見明顯差異，但出現(xiàn)了增殖活性升高的趨勢。在高氟組，高表達(dá)了UCP2的HK2的增殖活性進一步降低，且與高氟組正常HK2比較后，出現(xiàn)了顯著的抑制作用(P<0.05)。高鈣可以拮抗氟中毒對高表達(dá)了UCP2的HK2細(xì)胞的增殖抑制作用，但差異不顯著(P>0.05)。各劑量染氟組腎小管上皮細(xì)胞中STC1的mRNA表達(dá)與對照組大鼠比較均有明顯提高，差異有顯著性(P<0.05)；高

22、鈣可促進STC1的表達(dá)。高表達(dá)UCP2的HK2中STC1的表達(dá)均顯著高于對應(yīng)劑量的正常HK2組(P<0.05)。高鈣可以使該表達(dá)增強，但差異無顯著性(P>0.05)；腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量在不同劑量染氟組均顯著高于對照組，且兩兩相比，差異有顯著性(P<0.05)。當(dāng)給予高鈣處理后，正常腎小管上皮細(xì)胞中鈣離子含量會出現(xiàn)顯著降低，且兩兩相比，差異有顯著性(P<0.05)；細(xì)胞內(nèi)鈣含量在轉(zhuǎn)染了UCP2的腎小管上皮細(xì)胞高染氟組中較之正常HK

23、2細(xì)胞高染氟組出現(xiàn)了顯著下降，在低、中染氟組雖未出現(xiàn)顯著的變化，但也呈現(xiàn)下降趨勢(P>0.05)。在各染氟組給予轉(zhuǎn)染了UCP2的腎小管上皮細(xì)胞高鈣干預(yù)后，對照正常HK2的相應(yīng)染氟組，細(xì)胞內(nèi)鈣含量出現(xiàn)了下降趨勢，在中氟加鈣、高氟加鈣組出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)
　　結(jié)論：氟中毒對腎小管上皮細(xì)胞的生存率有明顯的抑制作用，并能提高UCP2、STC1的表達(dá)，這種改變可隨著染氟劑量的增高而愈加明顯；氟中毒能影響腎小管上皮細(xì)胞的線粒體解偶