腎損傷分子-1在單側輸尿管梗阻大鼠腎組織中表達及雷帕霉素對其表達的影響.pdf

1、目的:腎間質纖維化(renalinterstitialfibrosis，RIF)是所有慢性腎臟病的共同結果，同時也是造成腎功能不可逆性損害的原因之一，延緩甚至逆轉腎間質纖維化對于延緩慢性腎臟病的進展、延長患者壽命意義重大。腎損傷分子(kidneyinjurymolecule(1)，KIM-1)是一種新型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，在正常大鼠腎組織僅有極微量的表達，而在多種急性腎損傷模型中，如缺血再灌注損傷、中毒性腎損傷、造影劑腎病等中表達明顯增加

2、，且隨腎臟結構和功能的修復其表達消退，因其在急性腎損傷診斷中靈敏性和特異性較高，目前成為一種較好的急性腎損傷的生物學標記物。同時也有研究發(fā)現(xiàn)KIM-1在慢性腎臟病(chronickidneydisease，CKD)時也有表達，已在蛋白超負荷腎病模型、阿霉素腎病、血管緊張素Ⅱ誘導純合子Ren2大鼠腎損傷及多囊腎模型中得到證實，然而在CKD中KIM-1表達的具體分子機制及病理生理學意義尚不清楚。國內有學者分別觀察了KIM-1和缺氧誘導因子-

3、1(hypoxia-induciblefactor1alpha，HIF-1α)在造影劑腎病大鼠模型和人近端腎小管上皮細胞(HK2)缺氧復氧過程中的表達情況及相互關系，結果均提示二者之間可能存在一定聯(lián)系，KIM-1可能作為HIF-1α的下游靶點參與腎臟損傷和修復過程。本課題擬通過建立單側輸尿管梗阻(unilateralureteralobstruction，UUO)大鼠腎間質纖維化模型，觀察腎組織的病理改變，結合免疫組織化學、PCR等檢測

4、手段，觀察KIM-1、HIF-1α及α-SMA在腎間質纖維化大鼠腎組織中的表達變化以及應用HIF-1α抑制劑雷帕霉素后對其表達的影響，并進一步探討KIM-1與HIF-1α、α-SMA的相互關系以及雷帕霉素對UUO大鼠的腎臟保護作用，為臨床防治慢性腎臟病的進展提供實驗性理論依據(jù)。
　　 方法:健康清潔級雄性SD大鼠72只，體重200±20g，隨機分為假手術組（Sham組），模型組(UUO組)，治療組(Rap組)，每組24只。UUO

5、組和Rap組行左側輸尿管結扎并剪斷，建立UUO模型;Sham組僅游離左側輸尿管，但不結扎和剪斷。各組于手術前1天開始給藥，根據(jù)體重調整藥量，Rap組以雷帕霉素2mg/kg/d灌胃，Sham組與UUO組以等容積生理鹽水灌胃，直至術后第14天。各組分別于術后1、4、7、14天隨機處死6只大鼠，取左側腎組織，一部分置于4％多聚甲醛中，用于HE染色觀察病理改變，免疫組化染色法檢測KIM-1、HIF-1α及α-SMA蛋白的表達，另一部分置于液氮中

6、快速冷凍，隨后轉至-80℃冰箱中保存，用于RT-PCR法檢測各因子的mRNA水平，然后分別采用圖像分析系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)進行半定量分析。應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:1、實驗大鼠腎組織形態(tài)學變化
　　 Sham組大鼠兩側腎臟大小相當，外觀無明顯差別;UUO組和Rap組梗阻側腎臟體積大于對側，且隨梗阻時間的延長體積逐漸增大，可見腎實質較對側明顯變薄，顏色

7、變淺，腎盂腎盞擴張變形，腎內積水，尤以術后14天最為顯著。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Sham組腎小球和腎小管結構均未見明顯異常，UUO組和Rap組術后1天腎組織病理改變不明顯，從術后4天病變較明顯，開始出現(xiàn)腎小管擴張，腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，炎癥細胞浸潤，腎間質水腫，且隨著梗阻時間延長，病變逐漸加重。與UUO組相比，Rap組大鼠腎組織病理學變化較輕。
　　 2、免疫組織化學結果
　　 KIM-1在Sham組各個時間點均無明顯表達，

8、在UUO組于術后1天表達即開始增加，主要表達于近端腎小管上皮細胞，且隨著時間推移表達明顯升高，各時間點比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;與同期UUO組相比，Rap組KIM-1表達均降低(P＜0.05)。HIF-1α在Sham組腎小管上皮細胞偶見表達，腎小球內無陽性表達，各時間點比較差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;與同期Sham組相比，UUO組術后1天表達開始增加，且隨著時間推移，表達呈上升趨勢，14天時表達最強，各時間點比較差異有

9、統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與同期UUO組相比，Rap組HIF-1α表達均受到明顯抑制（P＜0.05）。α-SMA在Sham組腎間質內未見明顯表達，僅在腎小動脈高表達，UUO組術后1天表達開始增加，且隨著時間推移，表達明顯增高，除血管壁平滑肌細胞表達外，腎間質和部分腎小管上皮細胞周圍均有表達，各時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與同期UUO組相比，Rap組α-SMA表達均降低(P＜0.05)。
　　 3、RT-PCR結

10、果
　　 與同期Sham組相比，術后1、4、7、14天UUO組大鼠腎組織中KIM-1mRNA、HIF-1αmRNA、α-SMAmRNA表達均增加(P＜0.05)，而給予雷帕霉素干預后，與同時期UUO組相比，Rap組大鼠腎組織中KIM-1mRNA、HIF-1αmRNA、α-SMAmRNA表達均有所下降(P＜0.05)，但較Sham組表達明顯增高(P＜0.05)。
　　 4、相關性分析
　　 對KIM-1mRNA表達

11、水平與HIF-1α、α-SMAmRNA的表達情況進行Pearson相關分析，結果表明:KIM-1mRNA與HIF-1αmRNA的表達水平呈正相關(r=0.874，P＜0.05);KIM-1mRNA與α-SMAmRNA的表達水平亦呈正相關(r=0.886，P＜0.05)。
　　 結論:在單側輸尿管梗阻大鼠腎組織中，HIF-1α、KIM-1和α-SMA表達均升高;使用雷帕霉素干預后，HIF-1α、KIM-1和α-SMA的表達下調，腎