糖尿病大鼠腎組織Nrf2、NQO1的表達(dá)及蝦青素對其干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetesmellitus，DM)患者的主要慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要病因。其主要臨床特點(diǎn)為逐漸出現(xiàn)的蛋白尿及腎功能損害，病理表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張、間質(zhì)纖維化等。在糖尿病腎臟損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及腎臟固有細(xì)胞的凋亡發(fā)揮了重要作用。高糖環(huán)境可以導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過多的活性氧(Reactive oxygen spec

2、ies，ROS)，從而進(jìn)一步活化相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，致使細(xì)胞因子及生長因子的失調(diào)。核因子E2相關(guān)因子(Nuclear factor E2-related factor2，Nrf2)是機(jī)體調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2能夠激活抗氧化反應(yīng)元件(Anti-oxidative response element，ARE)的基因序列，使下游的抗氧化物質(zhì)和Ⅱ相解毒酶表達(dá)增加，而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。目前Nrf2/ARE通路的研究主要在抗老化、抗凋

3、亡以及抗腫瘤等方面，而關(guān)于糖尿病腎病氧化應(yīng)激的研究甚少。蝦青素屬于類胡蘿卜素的一種，具有很好的抗氧化能力，能更有效的防治各種疾病，如腫瘤、糖尿病、糖尿病腎病和心血管疾病等。蝦青素是否可以通過激活Nrf2/ARE信號通路減輕糖尿病腎病氧化應(yīng)激反應(yīng)的國內(nèi)外研究比較少見。本課題擬通過應(yīng)用蝦青素對鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，應(yīng)用分子生物學(xué)檢測方法，觀察大鼠腎臟組織中Nrf2、NAD(P)H醌氧

4、化還原酶1(Nicotinamide quinone oxidoreductase1,NQO1)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量變化。探討蝦青素是否通過Nrf2/ARE途徑改善大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而延緩腎損傷的發(fā)展，為DN的防治提供理論依據(jù)。
　　方法:選擇36只清潔級雄性健康SD大鼠，體重約180～220g（購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），隨機(jī)抽取24只制備糖尿病模型，剩余12只作為正常對照組(NC組，n=

5、12)。1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將大鼠禁食12小時(shí)，腹腔內(nèi)一次性注射STZ65mg/kg，72h后用羅氏血糖儀從大鼠尾靜脈采血測血糖≥16.7mmol/L為造模成功。NC組大鼠僅予以同等劑量的枸櫞酸緩沖液腹腔內(nèi)注射。造模成功后，將糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組(DM組，n=12)、蝦青素干預(yù)組(ATX組，n=12)。ATX組自第二天起予以蝦青素25mg/kg灌胃，每天1次，NC組與DM組灌以等量植物油。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝取食水，不進(jìn)行任何藥物干預(yù)

6、。觀察12周。于干預(yù)后8周、12周末從各組隨機(jī)抽取6只大鼠，置于代謝籠內(nèi)收集24h尿液標(biāo)本，以測定24小時(shí)尿蛋白量(24 hours urinary protein,24hUP);稱重后向腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛麻醉，心臟取血，分離血清，用于測定血肌酐、尿素氮和血糖;處死大鼠，雙腎剝除腎臟的包膜后稱重，切取腎臟用于蘇木素伊紅(HE)、糖原染色(PAS)，觀察腎組織病理變化;免疫組織化學(xué)方法檢測Nrf2、NQO1的表達(dá)情況;取部分腎皮質(zhì)以

7、制備皮質(zhì)勻漿測定MDA、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)含量，Real time PCR檢測Nrf2、NQO1mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，不滿足正態(tài)和方差齊性的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:NC組大鼠皮毛光滑，體重逐漸增加。DM組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、飲水、進(jìn)食和尿量增

8、加等癥狀，隨著時(shí)間推移，逐漸出現(xiàn)腹瀉、毛色晦暗、體重下降、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象。ATX組大鼠上述情況比DM組好。與NC組比，DM組和ATX組24小時(shí)尿蛋白量、血糖、血肌酐及尿素氮均增加(P＜0.05);ATX組24小時(shí)尿蛋白、血肌酐及尿素氮比DM組下降(P＜0.05)，兩組間血糖下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。光鏡下觀察各組腎臟組織HE及PAS染色，NC組腎小球、腎小管無明顯的病理改變。DM組腎小球體積增大、系膜基質(zhì)增生、細(xì)胞增多、基底膜增

9、厚，ATX組腎臟的病理改變較DM組輕。8、12周DM組腎皮質(zhì)勻漿中MDA濃度顯著升高，ATX組明顯低于DM組(P＜0.05)，DM組T-AOC水平較NC組降低，ATX組水平明顯高于DM組(P＜0.05)。8周、12周末，DM組與NC組比較腎組織中Nrf2、NQO1的表達(dá)增多，ATX組高于DM組(P＜0.05)。PCR表達(dá)趨勢與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。
　　結(jié)論:糖尿病狀態(tài)下，大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)抗氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加;蝦青素能