三種食源性致病菌多重PCR快速檢測方法的研究.pdf

1、食品安全作為一個重大的世界性公共衛(wèi)生問題,越來越受到人們的重視。在各類食品安全事件中,由細菌引起的食物中毒事件占有較大的比例,是引起食物中毒的重要因素之一。其中,沙門氏菌(Salmonella)、單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)是3種典型的人畜共患病致病菌,它們能夠污染多種食品。目前,國內(nèi)檢測食品中致病菌主要采用傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)、生化鑒定的

2、方法,其操作繁瑣,檢測時間較長,通常需要一周才能完成,且靈敏度較低,已經(jīng)不能滿足食品中致病菌快速靈敏檢測的需要。與普通PCR有相同原理的多重PCR是一種快速、高效且高通量的檢測方法,能同時檢測多種食源性致病菌,節(jié)省成本和時間,該方法在致病菌檢測領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
　　 本研究根據(jù)沙門氏菌菌毛fimy基因、單增李斯特氏菌溶血素hlyA基因和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌粘附侵襲位點ail基因設(shè)計了三對特異性引物,建立了同時檢測三種食源

3、性致病菌的多重PCR方法。根據(jù)影響多重PCR反應(yīng)的因素,利用兩個正交試驗設(shè)計分別對多重PCR反應(yīng)體系中的三對引物量添加比進行L9(33)正交優(yōu)化和Taq酶、dNTPs、鎂離子、混合引物的添加量進行L16(44)正交優(yōu)化,然后對退火溫度和Buffer的反應(yīng)濃度進行優(yōu)化,最終確定多重PCR反應(yīng)體系為25μL:3.8μL10×PCRbuffer,1.5μLMg2+(50mmol/L),3.0μLdNTPs(各2.5mmol/L),0.3μLT

4、aq酶(5U/μL),沙門氏菌上下游引物1.0μL(10μmol/L),單增李斯特氏菌上下游引物1.5μL(10μmol/L),小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌上下游引物0.5μL(10μmol/L),模板各0.5μL,ddH2O8.9μL;反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5min,94℃變性45s,59.8℃退火45s,72℃延伸45s,進行30個循環(huán),最后72℃延伸10min。
　　 通過引物特異性和反應(yīng)特異性試驗,證明該方法具有較好的特異性。

5、多重PCR擴增產(chǎn)物進行測序驗證,并將測序結(jié)果在GenBank上進行在線BLAST比對,證實了擴增產(chǎn)物的確是目的基因的擴增且同源性均達到99％以上。為了比較多重PCR檢測三種致病菌的特異性及靈敏度,建立單重PCR檢測體系作為對照。在最佳實驗條件下,多重PCR同時檢測三種食源性致病菌純培養(yǎng)物的靈敏度沙門氏菌為102CFU/mL、單增李斯特氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌均為103CFU/mL;采用試劑盒法提取DNA,在人工污染豬肉品中同時檢測三種

6、食源性致病菌的檢出限沙門氏菌為103CFU/g、單增李斯特氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌均為104CFU/g,其靈敏度和檢出限均略低于單重PCR檢測。人工污染豬肉樣品經(jīng)9h富集培養(yǎng)增菌后,其檢出限可達100CFU/g。
　　 對實際樣品進行檢測,并與國標法進行比較,證明該方法檢測三種食源性致病菌具有較高的敏感性、特異性和符合率。本研究建立的多重PCR檢測方法簡單、快速、準確、靈敏度高、低成本、高通量,具有較強的實際應(yīng)用價值,對控制病