重要食源性致病菌多重分子檢測(cè)方法的建立.pdf

1、大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和空腸彎曲菌(Campylobacter.jejuni)是導(dǎo)致人類食源性疾病的重要致病菌,甚至可能會(huì)導(dǎo)致人類的死亡。當(dāng)前普遍采用的致病菌國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法包括增菌培養(yǎng)、選擇性分離、生化鑒定以及血清學(xué)驗(yàn)證等步驟,需要5～7天才能完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程,并且難以實(shí)現(xiàn)有效

2、的多重檢測(cè)。食源性致病菌的快速檢測(cè)和鑒定方法不僅對(duì)食品企業(yè)內(nèi)部安全衛(wèi)生監(jiān)控極為重要,而且對(duì)政府部門履行食品安全監(jiān)管職能也十分迫切?；蛐酒?、多重實(shí)時(shí)熒光PCR等靈敏、高效、特異性強(qiáng)的食源性致病菌多重檢測(cè)方法的開發(fā)對(duì)于提高食品安全的保障水平具有重要意義。
　　 本研究針對(duì)目前食源性致病菌多重分子檢測(cè)方法中存在的主要問(wèn)題,開展一系列研究,結(jié)合多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL,建立了多重實(shí)時(shí)熒光PCR和基因芯片檢測(cè)方法,用于食品中重要致病菌

3、的多重分子檢測(cè),主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.亞致死損傷細(xì)胞的獲得及其在多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL中修復(fù)方法的建立
　　 在本研究中,我們首先研究了指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)55℃處理不同時(shí)間后,受熱致死和亞致死損傷曲線區(qū)別,探討不同細(xì)胞密度、生長(zhǎng)時(shí)期以及生長(zhǎng)代謝物質(zhì)等細(xì)胞生長(zhǎng)特性在導(dǎo)致致病菌數(shù)目降低3個(gè)數(shù)量級(jí)所需時(shí)間的規(guī)律性。根據(jù)選擇性平板XLD以及NASA上得出的細(xì)胞數(shù)目變化的規(guī)律,在55℃熱激下,鼠傷

4、寒沙門氏菌細(xì)胞的外膜和質(zhì)膜均受到了不同程度的損傷,并導(dǎo)致了部分細(xì)胞的死亡。不同細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期、細(xì)胞密度和具有不同生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的鼠傷寒沙門氏菌抵抗熱脅迫的能力具有很大的差異。在多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL中,經(jīng)過(guò)1 h的修復(fù)和20 h的增菌培養(yǎng),5 mL增菌培養(yǎng)液中＜10 CFU數(shù)目的亞致死損傷沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7或單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞均能夠修復(fù)并增菌至108 CFU/mL或以上,說(shuō)明SEL對(duì)于亞致死損傷細(xì)胞具有很好的修復(fù)并增

5、菌作用。
　　 2.食品中致病菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)的建立
　　 為了有效的從肉類食品中同時(shí)檢測(cè)出沙門氏菌、大腸桿菌O157和單核細(xì)胞增生李斯特菌,本試驗(yàn)結(jié)合多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL設(shè)計(jì)了一種多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。分別根據(jù)沙門氏菌、大腸桿菌O157以及單核細(xì)胞增生李斯特菌的特異性序列invA、rfbE以及hlyA基因設(shè)計(jì)多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和探針,并根據(jù)來(lái)源于人類腺病毒的一段基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增控制內(nèi)標(biāo)(

6、IAC),用以指示檢測(cè)的假陰性結(jié)果。將檢測(cè)目標(biāo)與IAC在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增,通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的評(píng)估和優(yōu)化,將可能發(fā)生的PCR競(jìng)爭(zhēng)擴(kuò)增降至最低。結(jié)合多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL,本多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法能夠同時(shí)從人工污染的碎牛肉樣品中檢測(cè)出三種目標(biāo)致病菌,檢測(cè)限低于18 CFU/10 g碎牛肉樣品,可以達(dá)到2～3CFU/10 g碎牛肉。而將傳統(tǒng)的非選擇性增菌培養(yǎng)液BPW用于同樣的人工污染樣品時(shí),單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長(zhǎng)受到明顯的抑制而不能

7、有效的檢出。本試驗(yàn)將整個(gè)檢測(cè)體系應(yīng)用于26個(gè)市售肉類樣品中,同時(shí)檢測(cè)這三種致病菌,樣品包括牛肉、雞肉、火雞肉和豬肉等,經(jīng)過(guò)在SEL中1 h的修復(fù)和20 h的增菌培養(yǎng),其中12個(gè)樣品中有1種致病菌檢出,3個(gè)樣品中有2種致病菌同時(shí)檢出,其它呈致病菌陰性的樣品中只能檢出IAC的擴(kuò)增曲線,傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法也證實(shí)了該多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,本研究建立的與多重選擇性增菌培養(yǎng)相結(jié)合的多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,是從肉類樣品中同時(shí)檢測(cè)

8、出一種或多種致病菌的快速、可靠方法。
　　 3.基因芯片制作技術(shù)的建立
　　 本研究采用表面襯托有γ-氨基丙基硅烷的Corning(R)UltraGAPSTM基片,對(duì)點(diǎn)樣緩沖液、探針濃度、探針長(zhǎng)度、目的DNA核酸擴(kuò)增策略、熒光染料標(biāo)記方法等進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。結(jié)果表明,采用50％的DMSO作為點(diǎn)樣緩沖液,～70 nt長(zhǎng)度以及25 mM濃度的探針制作得到的基因芯片,可以得到結(jié)果均一、信號(hào)強(qiáng)度較高、特異性較好的芯片雜交結(jié)果；本試驗(yàn)

9、比較了引物特異性多重PCR擴(kuò)增方法和全基因組隨機(jī)擴(kuò)增方法得到的產(chǎn)物在檢測(cè)芯片上的雜交結(jié)果,結(jié)果表明,與隨機(jī)擴(kuò)增方法相比,多重PCR擴(kuò)增方法,并結(jié)合6堿基隨機(jī)引物用Klenow酶標(biāo)記得到的目標(biāo)特異性擴(kuò)增片段在檢測(cè)芯片上具有較高的雜交特異性；在每個(gè)待檢測(cè)樣品的標(biāo)記以及染色體系中使用25 U的Klenow酶和1/4管的Cy5染料即可得到檢測(cè)所需要的信號(hào)強(qiáng)度。
　　 4.食品中致病菌基因芯片檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)
　　 本研究采用約70

10、 nt的寡核苷酸探針,設(shè)計(jì)針對(duì)食品中沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌和空腸彎曲菌的特異性檢測(cè)芯片,大腸桿菌O157:H7的志賀毒素分泌類型(stx1和stx2)也能夠同時(shí)被檢出。為了降低檢測(cè)成本,每一個(gè)芯片上設(shè)計(jì)有12個(gè)相同的次陣列,可以用于12個(gè)食品樣品的同時(shí)檢測(cè)。多重PCR方法能在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增出上述致病菌中的14個(gè)目標(biāo)核苷酸序列,與單PCR相比,檢測(cè)效率得到了顯著增加。與目的片段多重。PCR擴(kuò)增相結(jié)合