重要食源性致病菌多重分子檢測方法的建立.pdf

1、大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和空腸彎曲菌(Campylobacter.jejuni)是導致人類食源性疾病的重要致病菌,甚至可能會導致人類的死亡。當前普遍采用的致病菌國標檢測方法包括增菌培養(yǎng)、選擇性分離、生化鑒定以及血清學驗證等步驟,需要5～7天才能完成整個檢測過程,并且難以實現有效

2、的多重檢測。食源性致病菌的快速檢測和鑒定方法不僅對食品企業(yè)內部安全衛(wèi)生監(jiān)控極為重要,而且對政府部門履行食品安全監(jiān)管職能也十分迫切?；蛐酒?、多重實時熒光PCR等靈敏、高效、特異性強的食源性致病菌多重檢測方法的開發(fā)對于提高食品安全的保障水平具有重要意義。
　　 本研究針對目前食源性致病菌多重分子檢測方法中存在的主要問題,開展一系列研究,結合多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL,建立了多重實時熒光PCR和基因芯片檢測方法,用于食品中重要致病菌

3、的多重分子檢測,主要研究內容和結果如下:
　　 1.亞致死損傷細胞的獲得及其在多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL中修復方法的建立
　　 在本研究中,我們首先研究了指數生長期和穩(wěn)定期鼠傷寒沙門氏菌經55℃處理不同時間后,受熱致死和亞致死損傷曲線區(qū)別,探討不同細胞密度、生長時期以及生長代謝物質等細胞生長特性在導致致病菌數目降低3個數量級所需時間的規(guī)律性。根據選擇性平板XLD以及NASA上得出的細胞數目變化的規(guī)律,在55℃熱激下,鼠傷

4、寒沙門氏菌細胞的外膜和質膜均受到了不同程度的損傷,并導致了部分細胞的死亡。不同細胞生長時期、細胞密度和具有不同生長代謝產物的鼠傷寒沙門氏菌抵抗熱脅迫的能力具有很大的差異。在多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL中,經過1 h的修復和20 h的增菌培養(yǎng),5 mL增菌培養(yǎng)液中＜10 CFU數目的亞致死損傷沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7或單核細胞增生李斯特菌細胞均能夠修復并增菌至108 CFU/mL或以上,說明SEL對于亞致死損傷細胞具有很好的修復并增

5、菌作用。
　　 2.食品中致病菌多重實時熒光PCR檢測技術的建立
　　 為了有效的從肉類食品中同時檢測出沙門氏菌、大腸桿菌O157和單核細胞增生李斯特菌,本試驗結合多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL設計了一種多重實時熒光PCR檢測方法。分別根據沙門氏菌、大腸桿菌O157以及單核細胞增生李斯特菌的特異性序列invA、rfbE以及hlyA基因設計多重實時熒光PCR檢測引物和探針,并根據來源于人類腺病毒的一段基因序列設計擴增控制內標(

6、IAC),用以指示檢測的假陰性結果。將檢測目標與IAC在同一個反應體系中擴增,通過對反應體系的評估和優(yōu)化,將可能發(fā)生的PCR競爭擴增降至最低。結合多重選擇性增菌培養(yǎng)液SEL,本多重實時熒光PCR方法能夠同時從人工污染的碎牛肉樣品中檢測出三種目標致病菌,檢測限低于18 CFU/10 g碎牛肉樣品,可以達到2～3CFU/10 g碎牛肉。而將傳統的非選擇性增菌培養(yǎng)液BPW用于同樣的人工污染樣品時,單核細胞增生李斯特菌的生長受到明顯的抑制而不能

7、有效的檢出。本試驗將整個檢測體系應用于26個市售肉類樣品中,同時檢測這三種致病菌,樣品包括牛肉、雞肉、火雞肉和豬肉等,經過在SEL中1 h的修復和20 h的增菌培養(yǎng),其中12個樣品中有1種致病菌檢出,3個樣品中有2種致病菌同時檢出,其它呈致病菌陰性的樣品中只能檢出IAC的擴增曲線,傳統標準培養(yǎng)方法也證實了該多重實時熒光PCR檢測結果的準確性。因此,本研究建立的與多重選擇性增菌培養(yǎng)相結合的多重實時熒光PCR檢測方法,是從肉類樣品中同時檢測

8、出一種或多種致病菌的快速、可靠方法。
　　 3.基因芯片制作技術的建立
　　 本研究采用表面襯托有γ-氨基丙基硅烷的Corning(R)UltraGAPSTM基片,對點樣緩沖液、探針濃度、探針長度、目的DNA核酸擴增策略、熒光染料標記方法等進行系統優(yōu)化。結果表明,采用50％的DMSO作為點樣緩沖液,～70 nt長度以及25 mM濃度的探針制作得到的基因芯片,可以得到結果均一、信號強度較高、特異性較好的芯片雜交結果；本試驗

9、比較了引物特異性多重PCR擴增方法和全基因組隨機擴增方法得到的產物在檢測芯片上的雜交結果,結果表明,與隨機擴增方法相比,多重PCR擴增方法,并結合6堿基隨機引物用Klenow酶標記得到的目標特異性擴增片段在檢測芯片上具有較高的雜交特異性；在每個待檢測樣品的標記以及染色體系中使用25 U的Klenow酶和1/4管的Cy5染料即可得到檢測所需要的信號強度。
　　 4.食品中致病菌基因芯片檢測技術的開發(fā)
　　 本研究采用約70

10、 nt的寡核苷酸探針,設計針對食品中沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單核細胞增生李斯特菌和空腸彎曲菌的特異性檢測芯片,大腸桿菌O157:H7的志賀毒素分泌類型(stx1和stx2)也能夠同時被檢出。為了降低檢測成本,每一個芯片上設計有12個相同的次陣列,可以用于12個食品樣品的同時檢測。多重PCR方法能在一個反應體系中同時擴增出上述致病菌中的14個目標核苷酸序列,與單PCR相比,檢測效率得到了顯著增加。與目的片段多重。PCR擴增相結合