結(jié)直腸癌中甲基化、羥甲基化差異基因探索及KIAA1199、AQP8、SOX9、BEST4、MAL和ADH1A基因的預(yù)后分析.pdf

1、表觀遺傳可以改變基因轉(zhuǎn)錄水平，但不會(huì)改變DNA序列。近些年，越來(lái)越多的科學(xué)家投入到5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）的研究中來(lái)。短短數(shù)年間，難以計(jì)數(shù)的文章報(bào)導(dǎo)了5hmC的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分布，功能以及與疾病的潛在關(guān)聯(lián)。5hmC的出現(xiàn)拓寬了我們對(duì)表觀調(diào)控的領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)，也為我們尋找結(jié)直腸癌相關(guān)基因提供新的線索。
　　在本研究中，我們運(yùn)用甲基化免疫共沉淀測(cè)序(DNA immunoprecipitati

2、onsequencing，MedIP-seq)和羥甲基化免疫共沉淀測(cè)序(Hydroxymethylafion DNAimmunoprecipitafion sequencing，hMeDIP-seq)，在6對(duì)結(jié)直腸癌樣本中，同步檢測(cè)了5mC和5hmC的變化，并運(yùn)用高通量RNA深度測(cè)序（High-throughputsequencing，RNA-seq），探索5mC、5hmC與轉(zhuǎn)錄水平之間的關(guān)系。之后，我們根據(jù)測(cè)序結(jié)果，選取了甲基化，羥甲

3、基化和表達(dá)都有差異的候選基因，在135對(duì)結(jié)直腸癌樣本中，進(jìn)行mRNA水平的檢測(cè)，并收集臨床病理資料與隨訪信息，分析候選基因轉(zhuǎn)錄水平與臨床病理參數(shù)以及預(yù)后之間的關(guān)系。
　　我們的結(jié)果顯示，5mC和5hmC總體含量在結(jié)直腸癌腫瘤組織比在配對(duì)癌旁組織中低。但是，在DNA的一些局部區(qū)域，例如外顯子，CpG島以及短散在重復(fù)序列中，5mC含量是升高的。而5hmC含量在CpG島岸、外顯子以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近丟失幅度很大。根據(jù)腫瘤組織與癌旁組織間

4、5mC、5hmC的分布狀況，我們發(fā)現(xiàn)了一些甲基化差異區(qū)段(differentially methylated region，DMR)和羥甲基化差異區(qū)段(differentially hydroxymethylated region，DhMR)。DMR和DhMR的分布具有一致性，在基因內(nèi)部，內(nèi)含子、基因間隔以及重復(fù)序列中富集。腫瘤組織中，甲基化上升區(qū)段主要在CpG島和CpG島岸，而下降區(qū)段主要在重復(fù)序列中。羥甲基化上升區(qū)段主要在啟動(dòng)子的C

5、pG位點(diǎn)，而在CpG島岸、增強(qiáng)子和外顯子中丟失。根據(jù)DMR、DhMR分布差異，以及RNA-seq的結(jié)果，我們篩選到一批在腫瘤與癌旁組織中，存在甲基化羥甲基化與mRNA表達(dá)差異的基因，并在135例結(jié)直腸癌患者的腫瘤與配對(duì)癌旁組織中檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)KIAA1199(0.112 vs.0.020)、SOX9(0.151vs.0.083)在腫瘤組織中表達(dá)上升，而AQP8(0.005 vs.0.238)、BEST4(0.004 v

6、s.0.282)、MAL(0.014 vs.0.194)和ADH1A(0.045 vs.0.713)在腫瘤組織中表達(dá)下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（中位表達(dá)水平;腫瘤組織vs.配對(duì)癌旁組織;P＜0.05）。我們進(jìn)一步分析這些基因轉(zhuǎn)錄水平和臨床病理資料之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)，KIAA1199表達(dá)在大于60歲的人群中較高（0.13 vs.0.10; P=0.06），AQP8在Duke's分期C和D期的患者中比A和B期表達(dá)高(0.003 vs.0.008

7、; P＜0.05),BEST4(0.005 vs.0.003;P=0.06),MAL(0.012vs.0.007，P＜0.05)和ADH1A(0.071 vs.0.021;P＜0.05)均與腫塊大小相關(guān)，在直徑小于5cm的腫塊組織中表達(dá)較低。其余包括TNM分期，組織學(xué)類(lèi)型、分化、浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理指標(biāo)，均為得到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異（P＞0.05;Kruskal-Wallis檢驗(yàn)）。運(yùn)用Kaplan-Meier生存分析后，發(fā)現(xiàn)這些基

8、因的mRNA表達(dá)變化與患者預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，腫瘤組織中，高表達(dá)這些基因的人群，預(yù)后較差，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，KIAA1199(P=0.027)、SOX9(P=0.043)、AQP8(P=0.033)、BEST4(P=0.004)、MAL(P=0.045)和ADH1A(P=0.001)。
　　總結(jié)而言，本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中存在甲基化和羥甲基化修飾的改變，包括全基因組水平與DNA特定區(qū)域。我們找到了6個(gè)腫瘤中異常表達(dá)，并且與預(yù)后相關(guān)