下丘腦AMPK及mTOR通路在LPS誘導(dǎo)厭食中的作用.pdf

1、本課題22研究了腹腔注射菌體脂多糖(LPS)，激活核因子(NF-κB)信號通路對食欲調(diào)節(jié)機(jī)制的影響。通過對LPS誘導(dǎo)厭食機(jī)制的研究，篩選出調(diào)節(jié)采食的關(guān)鍵基因及蛋白，從而確定了采用中樞灌注藥物的方法，干預(yù)LPS誘導(dǎo)的動物厭食，為改善LPS誘導(dǎo)的動物厭食提供理論依據(jù)。
　　 試驗(yàn)一:體重相近的8周齡健康小鼠24只，隨機(jī)均分成4組，飼養(yǎng)在環(huán)境控制的鼠房內(nèi)，室內(nèi)溫度控制在23±0.1自由采食和飲水。試驗(yàn)期，小鼠禁食24小時(shí)后，分別按照0

2、，10，100，1000μg/kg體重的劑量腹腔注射LPS。分別記錄注射后1、2、4、6、12、24小時(shí)的采食量及體重。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比，LPS處理的所有時(shí)間點(diǎn)的采食量均顯著降低(p＜0.01)，處理組內(nèi)小鼠24h的體重也顯著降低，但24小時(shí)以后，10μg及100μg處理組的小鼠的體重均出現(xiàn)了恢復(fù);在LPS處理組中，隨著LPS濃度的增加，動物的采食量和體重顯著降低。以上結(jié)果表明:LPS能夠降低動物的采食和體重，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。

3、
　　 試驗(yàn)二:8周齡體重相近的健康小鼠36只，隨機(jī)均分成4組，飼養(yǎng)在環(huán)境控制的鼠房內(nèi)，溫度控制在23±0.1由采食和飲水。試驗(yàn)前，所有小鼠禁食24h后，于18:00點(diǎn)分別按照0，100，500μg/kg體重的劑量腹腔注射LPS。注射LPS2小時(shí)后，將小鼠頸部移位處死，并迅速剝離下丘腦，進(jìn)行樣品分析。試驗(yàn)結(jié)果表明:LPS處理顯著的提高了下丘腦內(nèi)抑制食欲的基因POMC的mRNA水平(p＜0.05)。利用Western Blotin

4、g技術(shù)測定下丘腦內(nèi)FoxO1的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)FoxO1在Ser256和Thr24/FoxO3a(Thr32)位點(diǎn)的磷酸化水平顯著上調(diào)(p＜0.05)，并且顯著增強(qiáng)了細(xì)胞漿內(nèi)FoxO1的水平(p＜0.05);在測定細(xì)胞因子的基因表達(dá)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)LPS處理顯著提高了IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平(p＜0.05);NF-κB蛋白磷酸化測定過程中，發(fā)現(xiàn)LPS處理顯著地提高了NF-κB在Ser536位點(diǎn)的磷酸化水平(p

5、＜0.05)，同時(shí)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB在該位點(diǎn)的磷酸化水平也顯著提高;除此之外，AMPK在Thr172位點(diǎn)的磷酸化水平顯著下調(diào)，而mTOR在Ser2448位點(diǎn)及P70S6K在Thr389位點(diǎn)的磷酸化水平均顯著上調(diào)。上述結(jié)果提示:LPS處理可能是通過增加細(xì)胞因子的釋放，從而激活NF-κB信號通路，引起食欲基因的變化，而影響動物的采食量;另外，AMPK以及mTOR信號可能也參與了LPS引起的動物厭食。
　　 試驗(yàn)三:試驗(yàn)選用體重相近的

6、8周齡雄性昆明小鼠24只，隨機(jī)均分為A、B、C、D4個(gè)組。禁食24小時(shí)后，于18:00點(diǎn)A、C組小鼠腦室注射人工腦脊液(artificialcerebrospinal fluid，ACSF)，B、D組小鼠腦室注射AICAR。腦室注射1小時(shí)后，A、B組小鼠再腹腔注射LPS(500μg/kg BW)，C、D兩組注射生理鹽水，記錄采食量。樣品采集:在小鼠腹腔注射2h后，將小鼠頸部移位處死，隨后迅速剝離下丘腦，進(jìn)行樣品分析。結(jié)果顯示:腦室注射A

7、ICAR沒有影響LPS組小鼠的采食量(p＞0.05)，提示AMPK信號通路可能不是LPS誘導(dǎo)動物厭食中的關(guān)鍵通路。
　　 試驗(yàn)四:體重相近的8周齡雄性昆明小鼠24只，單籠飼養(yǎng)，飼喂基礎(chǔ)日糧，自由飲水。試驗(yàn)期將小鼠隨機(jī)平均分成A、B、C、D四個(gè)組。所有小鼠提前禁食24h后，于18:00點(diǎn)，A、C組腦室注射人工腦脊液1μl，C、D組按照20μg/μl的劑量腦室注射mTOR阻斷劑Rapamycin1μl。腦室注射1小時(shí)后，B、D組按照

8、500μg/kg體重的劑量腹腔注射LPS，另外兩組注射同劑量的生理鹽水。記錄1，2，4，6，12，24小時(shí)的采食量。樣品采集:在小鼠腹腔注射2h后，將小鼠頸部移位處死，隨后迅速剝離下丘腦，進(jìn)行樣品分析。由結(jié)果可知:腦室注射Rapamycin顯著提高了LPS誘導(dǎo)的厭食小鼠的采食量(p＜0.05)，顯著的下調(diào)了抑食基因POMC的mRNA水平(p＜0.05)，顯著的提高了NPY/AgRP的mRNA水平(p＜0.05);測定細(xì)胞因子的mRNA水

9、平發(fā)現(xiàn)，腦室注射Rapamycin，顯著降低了細(xì)胞因子IL-1α、TNF-α的mRNA水平(p＜0.05)，IL-1β的mRNA水平呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，而IL-6的mRNA水平?jīng)]有顯著的變化;另外，Rapamycin處理顯著降低了LPS誘導(dǎo)的FoxO1、NF-κB、mTOR、P70S6K的高磷酸化水平(p＜0.05)。以上所述結(jié)果提示:Rapamycin可能是通過降低細(xì)胞因子的釋放水平，使得調(diào)節(jié)食欲基因表達(dá)的蛋白的功能的恢復(fù)，從而食欲基因的