LPS-D-gal誘導急性肝炎小鼠模型的建立及mTOR信號通路的初步探索.pdf

1、急性肝炎作為臨床上一種常見病癥，其危害極其嚴重。然而到目前為止，其致病機制還不是很清楚。動物模型是研究該病的重要工具。脂多糖/D-氨基半乳糖胺（Lipopolysaccharide/D-galactosamine，LPS/D-gal）誘導的實驗小鼠急性肝炎模型是目前應用比較廣泛的動物模型，其能夠較好地模擬病毒性肝炎等急性肝炎的致病過程。對于該模型的一些研究表明LPS與D-gal在體內是通過不同的機制參與急性肝炎的致病過程，然而其具體機制

2、還有待進一步的研究。因此，深入研究LPS與D-gal各自在其中發(fā)揮的作用具有重要意義。另外，研究表明LPS/D-gal致病過程主要涉及到炎癥反應和細胞凋亡，據報道m(xù)TOR信號通路在這兩個病理過程中發(fā)揮重要作用。因此，探索mTOR信號在此疾病模型中變化對于認識急性肝炎的致病機制和抗肝炎藥物的研發(fā)具有一定的理論價值。
　　本論文主要分為三部分。首先是建立急性肝炎模型。以ICR、FVB、C57BL6三種不同品系小鼠作為實驗對象，研究LP

3、S/D-gal誘導急性肝炎的最佳藥物劑量以及性別差異對模型建立的影響。并以ICR小鼠為代表進行LPS/D-gal誘導的急性肝炎模型建立的相關指標評價，以及對LPS/D-gal作用不同時間點進行動態(tài)分析。其次，以ICR小鼠為實驗對象，對LPS與D-gal在該疾病模型中的作用機制進行了探索:(1)分別用LPS或D-gal單獨誘導實驗小鼠，研究它們各自在急性肝炎致病過程中的作用;(2)利用LPS預處理D-gal致敏的實驗小鼠，觀察小鼠存活情況

4、，分析LPS預處理改變存活率的原因;(3)實驗小鼠經D-gal致敏后，再用LPS進行誘導，分析D-gal在體內代謝的時間，以及一定程度的肝損傷對LPS作用的影響。最后，我們通過免疫印跡分析了mTOR信號途徑在LPS/D-gal誘導的急性肝炎中的變化，并通過抑制mTOR途徑來研究其在LPS/D-gal誘導的急性肝炎中可能發(fā)揮的作用。
　　通過上述實驗我們得到以下結果:
　　(1)一定劑量LPS/D-gal聯(lián)合作用均可引起ICR

5、、FVB、C57BL6三種不同品系小鼠產生致死性的急性肝炎，死亡時間均發(fā)生在6h以后。經過比較性別差異發(fā)現(xiàn)雌性小鼠對LPS/D-gal聯(lián)合作用反應更敏感。急性肝炎相關指標檢測結果發(fā)現(xiàn):ICR雌性小鼠經LPS/D-gal處理后6h，血清中轉氨酶水平顯著升高這說明肝臟組織受到了嚴重的損傷，病理切片結果確認了肝組織損傷。我們還發(fā)現(xiàn)炎性細胞因子TNFα、IL1β、IL6的mRNA表達水平顯著升高，凋亡相關蛋白Caspase3被激活和裂解，NF-

6、κB信號途徑和mTOR信號途徑均被激活。這些結果表明我們通過LPS/D-gal成功地誘導了ICR小鼠的急性肝炎及肝損傷。
　　(2) LPS或D-gal單獨作用均不能導致實驗小鼠死亡。LPS作用主要誘導了炎性因子TNFα及抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達。前者主要引起炎癥反應發(fā)生和誘導細胞凋亡，后者則發(fā)揮抗凋亡和肝細胞保護作用。而抗炎因子IL10的mRNA表達水平顯著升高以及NF-κB信號途徑被抑制表明LPS可能通過激活抗炎反應阻止炎

7、癥反應的過度發(fā)生。另外，免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，單獨的LPS可以誘導激活mTOR信號途徑。D-gal作為RNA合成的類似物抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的mRNA表達，誘導肝臟組織細胞凋亡。進一步的免疫印跡檢測結果表明，在D-gal作用6h后IκBα水平下降，表明NF-κB途徑被激活，但炎性因子TNFα的mRNA表達水平則沒有明顯變化，表明NF-κB途徑可能在其中發(fā)揮其它作用。接下來，我們探討了LPS在D-gal致敏小鼠前后的作用。我們發(fā)現(xiàn)在LP

8、S預處理1h內，炎性因子TNFα和抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達水平均逐步升高，抗炎因子IL10的表達水平則沒有明顯變化。存活率分析發(fā)現(xiàn)，LPS提前1h預處理D-gal致敏小鼠，對小鼠有一定的保護作用。而小鼠經D-gal致敏后，LPS則能加速小鼠死亡。
　　(3)免疫印跡分析表明，mTOR信號的激活與LPS/D-gal誘導的急性肝炎有一定的相關性。意想不到的是，mTOR的抑制劑Rapamycin盡管能夠抑制mTOR信號，但并不能有效

9、降低LPS/D-gal誘導急性肝炎的小鼠死亡，這提示mTOR信號在LPS/D-gal誘導的急性肝炎中可能起多重作用。
　　綜上所述，本研究通過LPS/D-gal成功地在3種不同品系的小鼠中誘導了急性肝炎，找到了適合于每一種小鼠的最佳LPS/D-gal使用劑量，并且還發(fā)現(xiàn)性別影響實驗小鼠對LPS/D-gal的敏感性，雌性小鼠是建立該模型理想的實驗動物。在LPS/D-gal誘導ICR雌性小鼠急性肝炎中，LPS的主要作用是促使炎性因子的

10、大量表達，介導炎癥反應的進程，在后期LPS也激發(fā)了抗炎反應。LPS誘導的炎性因子TNFα可能通過激活細胞內死亡受體誘導肝細胞凋亡，然而LPS同時激活了NF-κB信號通路啟動抗凋亡的保護機制，因此單獨使用LPS不能引起明顯的細胞凋亡。D-gal通過抑制抗凋亡蛋白的合成，從而增加肝細胞對LPS誘導分泌的TNFα的敏感性，導致細胞凋亡。最后，在LPS/D-gal誘導的急性肝炎模型中mTOR信號途徑被激活，然而其在此過程中發(fā)揮的作用還有待進一步