mTOR信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)肉雞腸道黏膜免疫應(yīng)激中的作用.pdf

1、腸道黏膜免疫系統(tǒng)在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，本研究即以LPS激發(fā)炎癥反應(yīng)為基礎(chǔ)建立活體和離體培養(yǎng)的腸道組織的免疫應(yīng)激模型，探討mTOR/p70S6K參與LPS激活的免疫應(yīng)答機(jī)制，并從日糧營養(yǎng)素的角度進(jìn)一步分析營養(yǎng)對(duì)免疫機(jī)能的調(diào)控，初步探討mTOR/p70S6K參與營養(yǎng)素調(diào)控的機(jī)制。
　　1.RAPA處理對(duì)肉雞腸道黏膜發(fā)育的影響
　　應(yīng)用mTOR的特異性抑制劑-雷帕霉素(RAPA)研究對(duì)腸道黏膜發(fā)育的影響。4d時(shí)，選取體

2、重相近的90只肉雞，分別腹腔注射0.4mg/kg BW（低劑量）、1.0mg/kgBW（高劑量）和RAPA溶解介質(zhì)（對(duì)照），每天定點(diǎn)注射一次，連續(xù)注射6d。試驗(yàn)結(jié)果顯示，RAPA能顯著的影響體重和腸道絨毛發(fā)育，導(dǎo)致體重明顯下降(P＜0.05)，絨毛萎縮、變短(P＜0.05)，死亡率升高(P＜0.05);并能顯著地降低腸道緊密連接蛋白Claudin1的蛋白表達(dá)(P＜0.05)。同時(shí)，免疫組化和Western Blot顯示腸道IgA表達(dá)顯著

3、降低(P＜0.05)，這表明mTOR參與腸道黏膜的發(fā)育和IgA蛋白的合成，在體內(nèi)腸道黏膜穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。
　　2.口服LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激對(duì)腸道黏膜免疫的影響機(jī)制
　　試驗(yàn)對(duì)4d的AA肉雞分別給予0.25mg/kg BW和0.50mg/kgBW的LPS口服處理，研究在LPS處理后4h-24h不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)腸道黏膜免疫機(jī)制的影響。檢測(cè)洗液中SIgA的濃度結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的LPS口服對(duì)十二指腸和空腸沒有顯著的影響，在回腸中

4、表現(xiàn)出有差異，尤其是500μg/kg BW的LPS處理后在回腸中呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性的規(guī)律性增加;同時(shí)，LPS處理后4h-6h的NF-κBp65和p38 MAPK蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，隨著時(shí)間延長差異漸小，至18h，21h時(shí)兩者的蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。結(jié)果表明，口服LPS處理可以引起腸道黏膜的免疫應(yīng)激，并能影響腸道表現(xiàn)在時(shí)間和空間的特異性。
　　3.體外腸道組織的培養(yǎng)及其建立的LPS免疫應(yīng)激模型
　　試驗(yàn)

5、應(yīng)用19胚齡的SPF雞胚建立離體的腸道組織培養(yǎng)模型，并分別用0，0.5，1，2μg/mL的LPS給予免疫應(yīng)激，觀察LPS處理2h和4h后對(duì)腸道組織的影響。結(jié)果顯示，SIgA的濃度在LPS處理后2h隨著LPS濃度的增加表現(xiàn)為逐漸升高的趨勢(shì)，且在2μg/mL的LPS處理后差異顯著(P＜0.05);各種炎性細(xì)胞因子的mRNA水平和NF-κB、MAPK信號(hào)蛋白的磷酸化水平結(jié)果也顯示，不同濃度的LPS均顯著的激活細(xì)胞因子的表達(dá)和NF-κB、MAP

6、K信號(hào)通路，尤以2μg/mL的LPS處理2h的差異最顯著(P＜0.05)，表明LPS可以引發(fā)體外培養(yǎng)的腸道組織的免疫應(yīng)激，激活TLR-NF-κB、MAPK-炎性細(xì)胞因子-SIgA信號(hào)通路。
　　4.mTOR參與調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎性機(jī)制
　　應(yīng)用試驗(yàn)3中模型，檢測(cè)可能與SIgA等蛋白合成相關(guān)的mTOR信號(hào)通分子，結(jié)果顯示，LPS處理腸道組織后，其mTOR/p70S6K的磷酸化水平均顯著地降低(P＜0.05)，這提示mTOR信號(hào)

7、通路可能參與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機(jī)制。同時(shí)，應(yīng)用試驗(yàn)3中2μg/mL的LPS處理2h建立的體外培養(yǎng)模型，用10mM、20mM和40mM的Leu來激活被抑制的mTOR信號(hào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40mM的Leu恢復(fù)了由LPS抑制的mTOR/p70S6K的磷酸化水平，并抑制了由單獨(dú)LPS處理顯著激活的炎性細(xì)胞因子、SIgA以及NF-κB p65、p38，JNK MAPK蛋白的磷酸化水平，這表明mTOR/p70S6K信號(hào)通路參與LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，調(diào)控

8、下游信號(hào)分子的免疫應(yīng)答。
　　5.mTOR參與5-HTP、VA等營養(yǎng)素調(diào)控免疫應(yīng)激的機(jī)制初探
　　本試驗(yàn)探討了日糧中添加5-HTP或VA對(duì)LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。
　　選取80只體重相近的肉雞，7d開始飼喂0.2％的5-HTP日糧和基礎(chǔ)日糧，連續(xù)飼喂4w后腹腔注射1 mg/kg BW LPS。結(jié)果顯示，基礎(chǔ)日糧下，LPS能顯著地降低了mTOR下游的p70S6K的磷酸化水平(P＜0.05)，顯著地激活I(lǐng)L

9、-6等炎性細(xì)胞因子和NF-κB、MAPK信號(hào)分子的表達(dá)(P＜0.05);而5-HTP日糧能降低炎性細(xì)胞因子的mRNA水平，且有效抑制了由LPS激活的NF-κB/MAPK-細(xì)胞因子的信號(hào)通路，這表明5-HTP緩解了LPS應(yīng)激誘導(dǎo)的炎性反應(yīng);同時(shí)5-HTP日糧也恢復(fù)了由LPS抑制的mTOR下游的p70S6K的磷酸化水平，提高了十二指腸洗液中SIgA的濃度(P＜0.05)。
　　同時(shí)，選取80只體重相近的肉雞，1d開始飼喂1500IU/

10、kg和6000IU/kg的兩種梯度VA日糧，連續(xù)飼喂10d后，應(yīng)用對(duì)呼吸道黏膜造成免疫應(yīng)激的LPS(1mg/kgBW)進(jìn)行噴霧2h處理。結(jié)果顯示，基礎(chǔ)日糧下，LPS噴霧處理顯著的激活了IL-6、TNF-α等炎性因子的基因表達(dá)和p38 MAPK的總蛋白表達(dá)(P＜0.05)，而日糧添加VA后，LPS噴霧處理后未見有炎性細(xì)胞因子的高表達(dá)和炎性通路的激活，同時(shí)腸道緊密連接蛋白的表達(dá)也相應(yīng)升高(P＜0.05)，且p70S6K的磷酸化水平較基礎(chǔ)日糧

11、組顯著升高(P＜0.05)，這體現(xiàn)了VA日糧對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，免受外界應(yīng)激的刺激損傷，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。本試驗(yàn)提示mTOR/p70S6K信號(hào)通路可能參與營養(yǎng)素調(diào)控免疫應(yīng)激對(duì)腸道黏膜免疫的機(jī)制中。
　　綜上所述，mTOR信號(hào)分子參與肉雞腸道黏膜的發(fā)育和SIgA蛋白的合成，同時(shí)應(yīng)用離體培養(yǎng)的腸道組織模型證實(shí)mTOR/p70S6K在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)5-HTP和VA等營養(yǎng)素能緩解不同方式的LPS應(yīng)激對(duì)腸道造