四種有機(jī)磷農(nóng)藥核酸適體的篩選、鑒定及其活性研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥是我國(guó)廣泛使用的殺蟲(chóng)劑，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥的最大允許殘留量為0.2 mg/kg，但近年來(lái)由于不合理的使用已嚴(yán)重的危害到我國(guó)的食品安全，因此發(fā)展快速的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)尤為重要。核酸適體(Aptamer)作為一種具有替代抗體潛能的新型仿生生物識(shí)別元素，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。在食品安全領(lǐng)域，已有抗生素、重金屬、食源性致病菌、生物毒素等多種物質(zhì)的核酸適體被成功篩選和應(yīng)用，但目前關(guān)于有機(jī)磷農(nóng)藥核酸適體的篩選和應(yīng)用還鮮見(jiàn)報(bào)道。本

2、研究利用SELEX技術(shù)對(duì)甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂(lè)果四種有機(jī)磷農(nóng)藥的DNA適體進(jìn)行了篩選，并對(duì)篩選獲得的適體的親和活性、特異性及活性位點(diǎn)進(jìn)行了研究，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.適體SELEX篩選中單鏈DNA的制備
　　 探討了在適體SELEX篩選中，利用凝膠捕獲法制備單鏈DNA(ssDNA)的試驗(yàn)條件，為適體SELEX篩選中次級(jí)庫(kù)的生成奠定基礎(chǔ)。將PCR擴(kuò)增后帶生物素和熒光標(biāo)記的dsDNA連接在鏈霉親和素標(biāo)

3、記的凝膠上，用NaOH變性解鏈制備ssDNA。結(jié)果表明:dsDNA與凝膠結(jié)合的時(shí)間40 min為佳;NaOH的濃度0.1 mol/L較適宜。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定表明優(yōu)化試驗(yàn)條件下制備的產(chǎn)物為ssDNA。這種制備ssDNA的方法操作簡(jiǎn)單、方便、所需時(shí)間短，制備的ssDNA帶有熒光標(biāo)記，便于用熒光法監(jiān)控適體的篩選過(guò)程，對(duì)于適體SELEX篩選中次級(jí)庫(kù)的生成是很好的選擇。
　　 2.四種有機(jī)磷農(nóng)藥DNA適體的篩選
　　

4、 利用SELEX技術(shù)從一個(gè)固定的隨機(jī)ssDNA庫(kù)中同時(shí)篩選甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂(lè)果四種有機(jī)磷農(nóng)藥的DNA適體。隨著篩選輪數(shù)的增加，四種有機(jī)磷農(nóng)藥從固定的隨機(jī)庫(kù)中洗脫的ssDNA逐漸富集，經(jīng)過(guò)12的輪篩選，篩選效率達(dá)到40.8％;對(duì)第12輪洗脫的ssDNA進(jìn)行克隆、測(cè)序，挑選的15個(gè)陽(yáng)性克隆均測(cè)序成功，由于部分克隆具有完全一致的序列，最終篩選到5條ssDNA序列;一級(jí)結(jié)構(gòu)序列分析表明5條ssDNA具有一定的同源性，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表

5、明5條ssDNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主，莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能是適體結(jié)合四種有機(jī)磷農(nóng)藥的基礎(chǔ)。
　　 3.適體活性鑒定方法的建立
　　 建立了基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號(hào)和分子信標(biāo)的兩種鑒定適體活性的熒光檢測(cè)策略，優(yōu)化了熒光檢測(cè)條件，并比較了兩種方法的檢測(cè)效果?；诮Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號(hào)的適體活性鑒定方法的影響因素試驗(yàn)表明:試劑本底、游離態(tài)的猝滅序列Q-B、四種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響較小，表明該熒光策略具有一定的可行性，熒光序列F-P

6、1與猝滅序列Q-B的添加比例為1∶2時(shí)，就能達(dá)到很好的熒光猝滅效果。基于分子信標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)抑制法的條件試驗(yàn)表明:設(shè)計(jì)的分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)既能夠成功閉合也能夠成功被核酸適體打開(kāi)，丙酮及四種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響較小，分子信標(biāo)性能穩(wěn)定;適體與分子信標(biāo)的添加比例為1∶1.25，孵育時(shí)間為50 min，孵育溫度為室溫，農(nóng)藥靶分子在分子信標(biāo)之前加入能夠取得較好的試驗(yàn)結(jié)果。兩種方法對(duì)混合適體的活性鑒定效果表明:基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號(hào)的方法熒光強(qiáng)度

7、變化較小，熒光回復(fù)率較低，不能很好的對(duì)適體活性做出判斷;基于分子信標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)效果明顯，更適用于適體的活性鑒定。
　　 4.適體的活性、特異性鑒定
　　 利用建立的基于分子信標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)抑制法對(duì)篩選到的5條ssDNA進(jìn)行了活性鑒定，5條ssDNA中SS2-55和SS4-54對(duì)四種有機(jī)磷農(nóng)藥表現(xiàn)出了較強(qiáng)的結(jié)合活性，水胺硫磷的抑制率高達(dá)75％以上，其它三種有機(jī)磷農(nóng)藥抑制率最低的也在39％以上。對(duì)于活性較高的SS2-55和S

8、S4-54適體利用9種結(jié)構(gòu)相似的農(nóng)藥進(jìn)行了特異性分析，結(jié)果表明兩條適體對(duì)九種農(nóng)藥的結(jié)合活性很低，抑制率都在15％以下。利用熒光結(jié)合超濾的方法對(duì)其平衡解離常數(shù)(Kd)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明SS2-55和SS4-54適體對(duì)四種有機(jī)磷農(nóng)藥的平衡解離常數(shù)在0.83～2.5μmol/L之間。這些結(jié)果說(shuō)明SS2-55和SS4-54適體對(duì)四種有機(jī)磷農(nóng)藥的親和活性、特異性較高，可能是結(jié)合四種有機(jī)磷農(nóng)藥的廣譜型適體。
　　 5.適體活性位點(diǎn)的研究與

9、分析
　　 利用適體剪切和拼接的手段對(duì)SS2-55和SS4-54適體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，并利用基于分子信標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)抑制法對(duì)改造的適體的活性進(jìn)行了鑒定，根據(jù)結(jié)構(gòu)改造前后適體活性的變化探索了適體結(jié)合四種有機(jī)磷農(nóng)藥的活性位點(diǎn);并利用紫外光譜法研究了四種有機(jī)磷農(nóng)藥和四種堿基的相互作用，結(jié)合適體結(jié)構(gòu)改造的結(jié)果，進(jìn)一步分析了適體Loop環(huán)上的結(jié)合位點(diǎn)?；谶m體剪切的活性位點(diǎn)分析表明:對(duì)于SS2-55適體，Loop2-4是四種有機(jī)磷農(nóng)藥共有的活性位

10、點(diǎn)，尤其對(duì)于氧化樂(lè)果至關(guān)重要;Loop2-3是識(shí)別甲拌磷的重要活性位點(diǎn);Loop2-1、Loop2-2是丙溴磷和水胺硫磷共有的活性位點(diǎn)。對(duì)于SS4-54適體5'端和3'端殘余的核苷酸對(duì)甲拌磷和氧化樂(lè)果是重要的活性位點(diǎn)，Loop4-2、Loop4-1是丙溴磷和水胺硫磷共有的活性位點(diǎn);Loop4-3是丙溴磷和氧化樂(lè)果共有的活性位點(diǎn)。基于適體片段拼接的適體活性位點(diǎn)分析表明:適體與農(nóng)藥靶分子的結(jié)合并不是簡(jiǎn)單的活性部位的堆積，有的活性部位可能不是

11、結(jié)合部位，但它卻對(duì)維持適體的活性有一定作用;幾個(gè)堿基的不同就可能引起適體活性很大的變化。紫外吸收光譜研究結(jié)果表明:四種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)四種堿基的紫外吸收光譜都有一定程度的影響，使四種堿基的吸收峰發(fā)生了紅移和減色效應(yīng);四種有機(jī)磷農(nóng)藥中，水胺硫磷與胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤的相互作用最強(qiáng)，氧化樂(lè)果與鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶的相互作用其次，而甲拌磷、丙溴磷與堿基之間的相互作用較弱。Loop環(huán)上的T、C堿基是水胺硫磷重要的結(jié)合位點(diǎn)，A、G堿基是氧化樂(lè)果