基于工業(yè)化生產(chǎn)的治療用單克隆抗體上游制備及放大工藝研究.pdf

1、目的:通過一系列的實驗室小試研究，確定治療用單克隆抗體上游制備工藝。根據(jù)大規(guī)模工業(yè)設(shè)備所能實現(xiàn)的控制參數(shù)，以及各控制參數(shù)所能達到的范圍及精度，核對、校正和補充實驗室獲得的數(shù)據(jù)，修訂為商業(yè)化生產(chǎn)用工藝用參數(shù)。
　　方法:實驗室小試階段通過對比，篩選不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基，得到最優(yōu)化的培養(yǎng)工藝。放大生產(chǎn)階段，通過查閱設(shè)備文獻以及通過測定工業(yè)級主要生產(chǎn)設(shè)備的關(guān)鍵參數(shù)，如細胞發(fā)酵罐的KLa，攪拌槳線速度等參數(shù)，確定細胞培養(yǎng)及蛋白表達

2、的參數(shù)范圍，然后與實驗室小規(guī)模條件下得到的工藝進行比較，修正。
　　結(jié)果:
　　1.不同的培養(yǎng)基條件下，培養(yǎng)同樣長的時間，7＃培養(yǎng)基的整體活細胞密度有85E6個/ml，而11＃培養(yǎng)基僅有18 E6個/ml，兩種培養(yǎng)基的總體活細胞密度相差5倍左右。其余培養(yǎng)基中，活細胞密度≤40 E6個/ml的，有4種;在40 E6個/ml到50 E6個/ml的，有5種;在50 E6個/ml到70 E6個/ml的，有7種;在70 E6個/ml到

3、85 E6個/ml的，有5種。
　　2.不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，表達目的蛋白的差別也較大。其中5＃和16＃培養(yǎng)基，分別有1.7 g/L和1.6 g/L。但8＃培養(yǎng)基中，目的蛋白僅有0.2 g/L。11＃和9＃由于在第12天活率就降低到60％以下，且細胞密度最低，無檢測表達量意義。
　　3.從各組總細胞密度來看，不管是化學成分限定的多肽混合物和傳統(tǒng)的蛋白水解物，加入到兩種培養(yǎng)基中，都不會對細胞生長產(chǎn)生大的影響，其波動范圍與未添加水解

4、物的對照組沒有明顯的區(qū)別。
　　4.從蛋白表達量看來，media1-cd4和media2-cd3的實驗組結(jié)果最高。而且，加入化學成分限定水解物的實驗組，其蛋白表達量在同一組實驗的不同搖瓶中，表現(xiàn)更為穩(wěn)定。
　　5.流加培養(yǎng)對目的蛋白的表達都具有積極的作用，在不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及水解物的組合中添加任意一種流加培養(yǎng)基都能有效地提高蛋白表達量。在主要質(zhì)量指標合格的實驗組中，以media1-cd4-F1 plus實驗組的目的蛋白表達量

5、最高，達到2.45 g/L。
　　6.在2L的生物反應(yīng)器內(nèi)攪拌槳槳尖速度1.6 m/s時，細胞活率已經(jīng)開始下降，略微降低攪拌槳速至1.4 m/s，此時未發(fā)現(xiàn)細胞有明顯的活率下降。
　　7.根據(jù)發(fā)酵罐的功率計算及放大公P/V=Ne·ρ1·n3·d52/V按單位體積輸出功率一致的原則放大，從細胞活率角度出發(fā)，在(恍懨。。匕兒，下術(shù))攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在≤194RPM，在200L規(guī)模時，攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在≤145 RPM。
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6、.在2L的小試規(guī)模生物反應(yīng)器上，在攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，溫度37℃，通氣速率20ml/min，反應(yīng)器內(nèi)加入為75％基礎(chǔ)培養(yǎng)基+25％補料培養(yǎng)基，測得KLa=0.002 s-1=7.2 h-1。
　　9.分別檢測了2L生物反應(yīng)器、50L生物反應(yīng)器、200L生物反應(yīng)器在槳尖速度0.3m/s，0.6 m/s，1.2 m/s的條件下的KLa。
　　10.采用檢測氯化鈉濃溶液的稀釋時間，驗證了混勻時間可以滿足細胞培養(yǎng)需求。
　　

7、11.根據(jù)KLa的檢測結(jié)果可知，通入空氣已經(jīng)可以滿足細胞對氧氣的需求，且通氣量應(yīng)＜0.1 vvm以避免產(chǎn)生泡沫。
　　結(jié)論:在治療用單克隆抗體的生產(chǎn)過程中，由于生產(chǎn)規(guī)模的變更，會導(dǎo)致蛋白生產(chǎn)條件的變化，從而引起蛋白特性的改變，進而影響藥品質(zhì)量。而由于生物制品的生產(chǎn)過程成本高昂，無法在工業(yè)級規(guī)模下進行工藝條件摸索，因此，通過關(guān)鍵參數(shù)的有針對性的工藝放大，可以在有限的成本及時間資源條件下，測試、鎖定工藝，使生產(chǎn)的產(chǎn)品特性與小試階段一致