耐高溫工程酵母菌株構(gòu)建及發(fā)酵纖維素糖化液產(chǎn)酒精分析.pdf

1、隨著石油資源日漸匱乏和全球環(huán)境污染問(wèn)題的日益加重,各國(guó)紛紛開始開發(fā)新型能源。纖維素是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源。利用生物技術(shù)將纖維素轉(zhuǎn)化為酒精,不僅節(jié)約資源,而且能夠?qū)崿F(xiàn)環(huán)境的保護(hù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用酶解法制備了葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生質(zhì)體,并研究了酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、預(yù)處理、滲透壓穩(wěn)定劑及pH值等因素對(duì)其形成和再生的影

2、響。結(jié)果表明,葡萄牙假絲酵母原生質(zhì)體形成的最佳條件為:菌齡8 h,酶濃度3.0 U/mL,酶解溫度30℃,山梨醇(1.0 mol/L,pH6.5)為滲透壓穩(wěn)定劑,酶解時(shí)間75 min;在此條件下,原生質(zhì)體的形成率為93.1％。釀酒酵母原生質(zhì)體形成的最佳條件為:菌齡8h,酶濃度2.0 U/mL,酶解溫度30℃,KCl(0.8 mol/L,pH7.5)為滲透壓穩(wěn)定劑,酶解時(shí)間60 min;在此條件下,原生質(zhì)體形成率為93.3％。兩株菌原生質(zhì)

3、體再生的最佳培養(yǎng)基均為含17％蔗糖的再生培養(yǎng)基,再生率分別為12.4％和24.1％。
　　 將葡萄牙假絲酵母原生質(zhì)體置于紫外燈(功率15 W、垂直距離為15 cm)下照射8 min后致死率達(dá)100％;釀酒酵母原生質(zhì)體置于70℃水浴鍋中處理40 min后致死率達(dá)100％。將滅活的雙親原生質(zhì)體進(jìn)行PEG誘導(dǎo)融合(頻率為2.7×10-6),經(jīng)過(guò)TTC初篩和發(fā)酵復(fù)篩,篩選出兩株既耐高溫又高產(chǎn)酒精的菌株:融合子F-26和F-6。兩融合子在

4、42℃下發(fā)酵酒精最終含量分別為7.4％和6.9％。對(duì)篩選獲得的融合子F-26與親株146l和1516進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的比較,可以看出融合子F-26細(xì)胞平均體積達(dá)到170.03 v/μm3,大于兩親本菌株的體積(24.97 v/μm3,154.02 v/μm3)小于兩親株的體積之和。
　　 對(duì)菌株F-26的生長(zhǎng)特性、發(fā)酵特性和耐受性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,菌株F-26生長(zhǎng)的最適溫度和pH分別為34℃和5.5;發(fā)酵的最適溫度和最適pH值分別

5、為34℃和5.0;最適接種量為12％;其中溫度和接種量對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響顯著;pH對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響不顯著;此外,菌株F-26的耐酒精能力為14％(v/v),并且可以耐受濃度為30％以上的糖,在濃度為40％的高糖下仍能發(fā)酵產(chǎn)酒精。
　　 采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了菌株F-26利用甘蔗渣纖維素糖化液發(fā)酵產(chǎn)酒精的工藝參數(shù)。在纖維素酶用量為25 IU/g甘蔗渣、酵母接種量為6％,糖化時(shí)間32 h條件下,以10％堿預(yù)處理后的甘蔗渣為底物,在42