纖維素分解菌的篩選及產(chǎn)乙烯木霉工程菌株的構(gòu)建.pdf

1、在當(dāng)前全球能源和環(huán)境向人類提出挑戰(zhàn)之時(shí)，開發(fā)利用可再生性資源已成為人類發(fā)展中的緊迫課題。本論文首先從堆肥、麥秸垛、土壤中采樣90多份，利用剛果紅纖維素培養(yǎng)基，結(jié)合搖瓶產(chǎn)酶試驗(yàn)進(jìn)行初篩，用麥秸粉固體發(fā)酵培養(yǎng)基復(fù)篩，共得劍7株分解纖維素能力較強(qiáng)的木霉和曲霉。固體發(fā)酵結(jié)果顯示：該7株野生型菌的濾紙酶活力均高于同批發(fā)酵的對(duì)照菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414和康寧木霉(Trichoderma koningii)AS

2、3.2774。對(duì)其中一株小霉D-124進(jìn)行形態(tài)特性分析和18s rDNA序列分析，初步鑒定該菌株為綠色木霉(Trichoderma viride)。 從大豆丁香假單胞菌(Pseudomonase syringae pv.glycinea)ICMP2189中克隆乙烯形成酶基因(efe)，將其插入劍絲狀真菌表達(dá)載體pTRIL(攜帶有纖維二糖酶基因chb I的啟動(dòng)子和終止子)上形成重組質(zhì)粒pTRIL-efe。然后將攜帶潮霉素抗性的質(zhì)粒

3、pAN7-1和重組質(zhì)粒pTRIL-efe共轉(zhuǎn)化T. viride的原生質(zhì)體。在含有潮霉素的再生培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)乙烯含量測(cè)定和PCR擴(kuò)增篩選得劍一個(gè)剛性T.viride轉(zhuǎn)化子，并通過southern雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，乙烯形成酶基因efe是以單拷貝的形式整合到T. viride的基因組中。將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在以纖維素為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上48h后，用氣相色譜儀測(cè)得乙烯產(chǎn)量為：1.059μL·g<'-1>.h<'-1>。接著我們測(cè)定了不同

4、碳源和氮源及不同含量對(duì)T. viride轉(zhuǎn)化子產(chǎn)乙烯的作用，結(jié)果表明培養(yǎng)基中的纖維素含量為2％時(shí)，乙烯產(chǎn)量最高；向培養(yǎng)基中添加蛋白胨可以提高乙烯的產(chǎn)量；以乳糖和羧甲基纖維素鈉作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的碳源時(shí)，乙烯的產(chǎn)量相對(duì)較低；而向誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加乙烯合成底物2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)時(shí)效果不太明顯。通過上述實(shí)驗(yàn)，我們確定了T. viride轉(zhuǎn)化子產(chǎn)乙烯的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為(g·L<'-1>)：纖維素粉20，蛋白胨2，(NH<,4

5、>)<,2>SO<,4>5，KH<,2>PO<,4> 15，MgSO<,4> 0.6，CaCl<,2> 0.6，F(xiàn)eSO<,4>·7H<,2>O 0.005，MnSO<,4>·H<,2>O 0.0016，ZnSO<,4>·7H<,2>O0.0014，CoCl<,2>0.002。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T. viride轉(zhuǎn)化子在靜置培養(yǎng)條件下的乙烯產(chǎn)量高于搖床培養(yǎng)。當(dāng)以小麥秸稈為原料進(jìn)行固體發(fā)酵48h，測(cè)得乙烯的產(chǎn)量為2.28μL/瓶，說明T.v