氧化纖維素基載體固定化β-半乳糖苷酶的研究.pdf

1、本課題根據(jù)纖維素結(jié)構(gòu)中多羥基的特點(diǎn)，利用高碘酸鈉選擇性氧化和環(huán)氧氯丙烷接枝于纖維素中不同位置的羥基，分別制備出雙醛氧化纖維素、環(huán)氧化雙醛氧化纖維素和雙醛氧化纖維素共聚磁性顆粒微球。根據(jù)氧化纖維素基載體結(jié)構(gòu)中的醛基或環(huán)氧基團(tuán)可以與酶分子結(jié)構(gòu)中的非活性氨基發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的原理，在不使用任何交聯(lián)劑或其它化學(xué)試劑的條件下，通過共價鍵結(jié)合形成亞胺結(jié)構(gòu)，使酶分子接枝在氧化纖維素基載體的表面，形成固定化酶。
　　分別以制備出的氧化纖維素基材料

2、為載體，進(jìn)行了β-半乳糖苷酶的固定化研究。制備出的固定化酶可水解牛奶中的乳糖，生產(chǎn)低乳糖產(chǎn)品，對于滿足乳糖不耐癥人群對乳制品的需求和開發(fā)高附加值的纖維素產(chǎn)品具有重要的理論和實(shí)踐意義。本課題是高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號:20060225008）中的部分內(nèi)容。
　　論文重點(diǎn)考察了不同氧化纖維素基載體固定化酶的制備工藝、酶學(xué)性質(zhì)、化學(xué)和微觀結(jié)構(gòu)以及固定化酶的應(yīng)用效果，主要研究結(jié)果如下：
　　(1)通過堿活化和

3、高碘酸鈉選擇性氧化，制備出C2，C3位雙醛氧化纖維素，首次采用C2，C3位雙醛氧化纖維素為載體進(jìn)行了β-半乳糖苷酶的固定化研究，結(jié)果表明:固定化時間4h，固定化溫度4℃，酶與載體的質(zhì)量比1∶15，固定化pH6.5時，固定化酶的活力最高為0.523±0.015U·g-1。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明:游離的β-半乳糖苷酶和雙醛氧化纖維素固定化酶的最適酶促反應(yīng)溫度為30℃，隨著溫度的升高，固定化酶的熱穩(wěn)定性要好于游離酶;游離的β-半乳糖苷酶和雙醛氧

4、化纖維素固定化酶的最適酶促反應(yīng)pH值為7.5，固定化酶的耐酸堿穩(wěn)定性要好于游離酶。米式方程分析結(jié)果表明，游離酶的Vmax=0.015μmol·min-1，Km=0.088mmol·L-1;固定化酶的Vmax=0.00446μmol·min-1，Km=0.169mmol·L-1，β-半乳糖苷酶經(jīng)過固定化后，對底物鄰硝基-β-D-吡喃半乳糖苷的親和力降低。經(jīng)重復(fù)使用5次后，固定化酶的相對酶活力為60.7±2.08％。
　　(2)以氯化

5、亞鐵、氯化鐵和氫氧化鈉為原料，通過化學(xué)共沉淀法合成Fe3O4磁性顆粒，將其與活化后的纖維素通過懸浮包埋技術(shù)制備出磁性纖維素顆粒，并通過高碘酸鈉將其選擇性氧化生成氧化纖維素共聚磁性顆粒微球。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4磁性顆粒的粒徑分布比較集中，平均粒徑為13.40μm。445nm條件下測得Fe3O4顆粒溶于無水乙醇溶液的吸光度值為0.287±0.012，在磁場中相應(yīng)的吸上高度為23±1.53mm。采用熱重分析可知:氧化纖維素共聚磁性顆粒中雙醛氧

6、化纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.8％，F(xiàn)e3O4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.2％。以氧化纖維素共聚磁性顆粒為載體制備固定化β-半乳糖苷酶，酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明:固定化酶的最適酶促反應(yīng)溫度為40℃，最適酶促反應(yīng)pH值為8.5，米式方程測定結(jié)果表明固定化酶的Vmax=0.00454μmol·min-1，Km=0.119mmol·L-1。采用真空過濾和磁鐵吸附兩種方式分別進(jìn)行固定化酶的重復(fù)性試驗(yàn)，經(jīng)重復(fù)使用6次后二者的相對酶活力分別為64.67±1.53％和

7、52.66±2.52％。
　　(3)以微晶纖維素為原料，依次通過堿活化、環(huán)氧氯丙烷接枝和高碘酸鈉選擇性氧化，生成C6-環(huán)氧化-C2，C3-雙醛氧化纖維素，測得其醛基含量為75.06％，環(huán)氧值為3.7mmol·g-1。以固定化時間、酶和載體的質(zhì)量比、固定化pH值為單因素，以固定化酶活力為考察指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，確定以環(huán)氧化雙醛氧化纖維素為載體制備固定化β-半乳糖苷酶的最優(yōu)工藝條件為:固定化時間4.16

8、h，酶與載體質(zhì)量比1∶18.3，固定化pH值6.6，此條件下固定化酶活力的預(yù)測值為0.572U·g-1，實(shí)測值為0.557±0.008U·g-1。通過Arrhenius經(jīng)驗(yàn)公式計算出以環(huán)氧化雙醛氧化纖維素為載體制備的固定化β-半乳糖苷酶的反應(yīng)活化能Ea=26.07kJ·mol-1，指前因子A=7.18×106。紅外光譜分析表明環(huán)氧化雙醛氧化纖維素載體結(jié)構(gòu)中的醛基和環(huán)氧基與β-半乳糖苷酶的氨基發(fā)生反應(yīng)形成固定化酶;掃描電鏡圖片表明球形的酶

9、分子接枝在環(huán)氧化雙醛氧化纖維素載體的表面。
　　(4)以雙醛氧化纖維素為載體制備固定化β-半乳糖苷酶，對固定化β-半乳糖苷酶水解乳糖的條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明:水解時間3h，水解溫度40℃，牛奶中的乳糖水解率可達(dá)到65.03±0.351％。對固定化酶水解后的低乳糖牛奶的品質(zhì)變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明:對比于未乳糖水解的超高溫滅菌牛奶，在相同的貯藏條件下，乳糖水解牛奶的pH變化顯著，黏度變化不顯著。以雙醛氧化纖維素為載體，分別制備了固