亞硝酸氧化細(xì)菌液態(tài)發(fā)酵工藝研究.pdf

1、亞硝酸氧化細(xì)菌作為硝化細(xì)菌兩個(gè)重要生理類群的其中之一，已經(jīng)被越來越多的研究工作者所重視。亞硝酸氧化細(xì)菌具有生長速度緩慢，自然條件下數(shù)量低等特點(diǎn)，這種特點(diǎn)一方面使亞硝酸氧化細(xì)菌的研究較為困難，另一方面也制約其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，對于提高亞硝酸氧化細(xì)菌生長速度與生長量的研究顯得極為重要。
　　 本課題針對實(shí)驗(yàn)室篩選得到的自養(yǎng)硝化桿菌y3-2(Nitrobacter sp.)，以菌濃度和生長速率為目標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并得到主要研究結(jié)果如

2、下：
　　 (1)通過Real-time PCR與MPN計(jì)數(shù)結(jié)果的比較，確立了Real-time PCR對y3-2計(jì)數(shù)的可行性。優(yōu)化了y3-2的DNA抽提方法，研究表明超聲波震蕩可以提高DNA的抽提效率，超聲波震蕩功率為200W最佳作用時(shí)間為2min。
　　 (2)利用單因素與正交試驗(yàn)相結(jié)合的辦法優(yōu)化了y3-2培養(yǎng)基配方，得到y(tǒng)3-2最佳培養(yǎng)基配方為CaCO30.5 g/L，Na2CO31.0 g/L，NaNO20.5

3、g/L，MgSO4·7H2O0.12 g/L，NaH2PO4·2H2O1.16 g/L，K2HPO4·3H2O0.33 g/L，MnSO4·H2O0.0076 g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O50μg/L。通過單因素試驗(yàn)考察了發(fā)酵條件如接種量，溫度，pH，轉(zhuǎn)速對y3-2生長的影響，獲得最佳發(fā)酵條件為接種量10%，溫度28℃，滅菌前初始pH值為6.8～7.1，搖床轉(zhuǎn)數(shù)200 rpm。優(yōu)化后，硝化桿菌y3-2批次發(fā)酵周期由優(yōu)化前的

4、7天縮短至4天，Real-time PCR計(jì)數(shù)菌濃度由優(yōu)化前的3.0×107cfu/ml提高到優(yōu)化后的4.0×109 cfu/ml，菌濃度提高了2個(gè)數(shù)量級。
　　 (3)考察了y3-2傳代的穩(wěn)定性及對有機(jī)質(zhì)和鈉鹽的耐受性，研究表明y3-2傳代穩(wěn)定，對有機(jī)質(zhì)的耐受性優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的其他亞硝酸氧化細(xì)菌，高濃度的鈉鹽對y3-2有較強(qiáng)的抑制作用，y3-2不適用于海水等含鹽量高的水體。
　　 (4)探索了y3-2分批發(fā)酵與間歇補(bǔ)料發(fā)

5、酵，并進(jìn)行了50L放大實(shí)驗(yàn)。50L分批發(fā)酵結(jié)果展示y3-2的發(fā)酵周期為4d，菌濃度提高到5.0×109 cfu/ml。50L間歇補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果顯示y3-2發(fā)酵周期為6d，菌濃度達(dá)到9.0×109 cfu/ml，并確定了NaNO2補(bǔ)加濃度為0.3g/L，補(bǔ)加開始時(shí)間為48h，補(bǔ)加結(jié)束時(shí)間為96h。
　　 (5)實(shí)驗(yàn)從CaCO3，溶氧，溫度，pH四個(gè)方面研究了它們對y3-2菌劑保藏的影響，獲得最佳保藏方案為pH調(diào)至6.5，-20℃+1