擬威克酵母利用中等碳鏈長(zhǎng)度烷烴合成槐糖脂的研究.pdf

1、生物表面活性劑主要是微生物在一定條件下培養(yǎng)時(shí)，在其代謝過程中分泌出的具有一定表面活性的代謝產(chǎn)物。生物表面活性劑與化學(xué)合成表面活性劑性能相似，但相比之下，生物表面活性劑可生物降解，具有較好的環(huán)境相容性，無毒或低毒，結(jié)構(gòu)多樣，可適用于多種環(huán)境。因此對(duì)生物表面活性劑已進(jìn)行廣泛的研究，并極有可能替代化學(xué)合成的表面活性劑。
　　 槐糖脂是一種重要的糖脂類生物表面活性劑，目前己獲得廣泛的研究?；碧侵肿佑捎H水性部分和疏水性部分組成，疏水性部

2、分是飽和或不飽和的十六或十八個(gè)碳原子的ω-（或ω-1）羥基脂肪酸，親水性部分是一分子槐糖（葡萄糖-β-1，2-葡萄糖苷），分為內(nèi)酯型和酸型兩大類。本實(shí)驗(yàn)室從環(huán)境中分離出的非致病性擬威克酵母菌株(Wickerhamiella domericqiae Y2A)可產(chǎn)生320 g/L的槐糖脂，具有極大的商業(yè)化應(yīng)用潛力。因此對(duì)槐糖脂深入研究有助于我們得到具有優(yōu)良表面特性的新型槐糖脂，為擴(kuò)展槐糖脂在日化、食品及醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

3、　　 本論文主要的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.對(duì)中等碳鏈長(zhǎng)度槐糖脂的分離、純化及鑒定。
　　 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加中等碳鏈長(zhǎng)度的烷烴（正辛烷、正癸烷、正十二烷和正十四烷）為親脂性底物，同時(shí)以只添加葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，采用HPLC-MS的方法分析擬威克酵母所產(chǎn)槐糖脂的種類，并采用GC-MS的方法分析槐糖脂粗品中脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度、不飽和度、末端羥基化的程度。以正辛烷為親脂性底物時(shí)，采用兩種分析方法均未檢測(cè)到中等碳鏈

4、長(zhǎng)度槐糖脂及脂肪酸的存在。以正癸烷為親脂性底物時(shí)，HPLC-MS分析可檢測(cè)到一定量的碳鏈長(zhǎng)度為14的酸型槐糖脂的存在。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入正十二烷時(shí)，兩種方法均可檢測(cè)到較大含量的碳鏈長(zhǎng)度為12和14的酸型槐糖脂。以正十四烷為親脂性底物時(shí)，可檢測(cè)到對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度的飽和及單不飽和的酸型槐糖脂。四種培養(yǎng)條件下均檢測(cè)到正常碳鏈長(zhǎng)度的酸型和內(nèi)酯型槐糖脂，未檢測(cè)到中等碳鏈長(zhǎng)度的內(nèi)酯型槐糖脂的存在。這些結(jié)果表明，通過向培養(yǎng)基中添加碳鏈長(zhǎng)度12以上的烷烴，可得

5、到大量碳鏈長(zhǎng)度為12和14的酸型槐糖脂。
　　 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)與脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)和代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析。
　　 分別選取四個(gè)與脂肪酸代謝和β氧化相關(guān)的基因和一個(gè)線粒體內(nèi)與脂肪酸延長(zhǎng)相關(guān)基因，檢測(cè)5個(gè)基因在以四種中等碳鏈長(zhǎng)度的烷烴為親脂性底物合成槐糖脂時(shí)的表達(dá)差異。與加入正辛烷相比，擬威克酵母在十四烷烴培養(yǎng)條件下，與脂肪酸代謝和β氧化相關(guān)的四個(gè)基因的表達(dá)量較大;同理，與正癸烷相比，在正十二烷烴培養(yǎng)條件下，與脂肪

6、酸代謝相關(guān)的四個(gè)基因的表達(dá)量較大。這表明擬威克酵母對(duì)較長(zhǎng)碳鏈的烷烴的降解幅度較大。
　　 3.編碼脂肪酸合酶α亞基基因的敲除及該基因敲除株（△F）所產(chǎn)槐糖脂組分分析。
　　 依據(jù)基因重組的原理和double-joint PCR的片段融合方法，構(gòu)建了長(zhǎng)度為6157 bp的攜帶潮霉素B抗性基因的編碼乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶基因（ura3）的敲除盒。采用電轉(zhuǎn)化的方法，成功得到尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型的擬威克酵母菌株。以此菌株為出發(fā)