阿魏菇凝集素分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、本文選用新疆特色資源阿魏菇為對(duì)象,對(duì)其分離純化、理化性質(zhì)及部分免疫活性進(jìn)行研究。
　　①阿魏菇凝集素(pleurotus ferulae Lectin,PFL)的分離純化
　　采用PBS(phosphate buffer saline)浸提、硫酸銨分級(jí)沉淀、超濾濃縮、離子交換層析初步分離以及瓊脂糖凝膠親和層析法純化的方法提取出了純度較高的PFL。選用的層析柱長為36 cm,直徑為1.1 cm,離子交換層析選用DEAE-cel

2、lulose52,柱材料與填料比為3:1;親和層析的填料為NaOH活化過的Sepharose-4B,柱材料與填料比為1:1,用PBS平衡液洗脫雜蛋白至A280<0.02,收集洗脫液透析處理,經(jīng)過電泳實(shí)驗(yàn)無蛋白條帶;再用0.25 mol/L D-半乳糖溶液解吸附至A280<0.02,流速為1mL/min,收集洗脫液透析,電泳,觀察到單一蛋白條帶電泳,表明PFL是由單一亞基組成的單聚體,并證實(shí)得到純度較高的PFL。
　?、赑FL電泳<

3、br>　　SDS-PAGE和非變性PAGE結(jié)果均得到單一蛋白帶,分子量17.5kDa左右,考馬斯亮藍(lán)R-250繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測得阿魏菇凝集素蛋白含量為84.33％。Native-PAGE是在不破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)和電荷的條件下,依據(jù)天然蛋白自身所帶電荷和在電場與介質(zhì)中泳動(dòng),可以鑒定分離到的蛋白的純度,同時(shí)有利于蛋白的回收利用。
　?、跴FL凝血活性研究
　　阿魏菇凝集素的最高凝集效價(jià)為28;溫度在0-60℃,凝血活在70℃以上穩(wěn)

4、定,凝血活性完全消失,證明該P(yáng)FL不耐高溫;凝集素在 pH環(huán)境高于2的酸性環(huán)境中穩(wěn)定, pH>10以上的堿性環(huán)境下,凝集素凝血活性全部消失;凝集素活性隨鹽度升高而增加, D-半乳糖可以有效的抑制PFL凝血活性,金屬離子Zn2+顯著增強(qiáng)凝集素的凝血活性。
　?、躊FL的基礎(chǔ)免疫活性研究
　　觀察凝集素對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用。采用MTT法,以不同濃度的凝集素與脾淋巴細(xì)胞共孵育48h,二甲基亞砜終止培養(yǎng),測定細(xì)胞培養(yǎng)液的吸光度