一支箭凝集素（Ophioglossum Pedunculosum Desv Agglutinin）的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、一支箭根部經(jīng)勻漿、浸取、硫酸銨分級(jí)沉淀、陰離子交換柱(DEAE-Sepharosc)和Sephacryl S-100分子篩層析得到經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶的一支箭凝集素(Ophioglossum pedunculosum Desv Agglutinin，OPA)純品。其表觀(guān)分子量為19.1kDa，亞基分子量為19.1kDa，表明OPA.是分子量約為19.1kDa的單體蛋白。凝血活性結(jié)果表明，OPA能凝集天然兔血細(xì)胞，其凝集兔血

2、細(xì)胞效價(jià)為1.95μg/ml。 OPA還能凝集人O型血細(xì)胞，但對(duì)人A、B型血均不凝集。糖抑制實(shí)驗(yàn)表明，甲狀腺球蛋白及甘露聚糖能夠強(qiáng)烈抑制其活性。 研究了不同溫度、pH和變性劑對(duì)OPA凝血活性和熒光光譜的變化，凝血活性在40℃以下保持相對(duì)的穩(wěn)定性，高于50℃，凝血活性逐步喪失，當(dāng)溫度達(dá)90℃時(shí)，OPA活性大部分喪失，100℃仍有20％的活性；pH為4-9時(shí)OPA活性相當(dāng)穩(wěn)定，最適pH為8；當(dāng)pH為11時(shí)，大部分凝血活性丟失，而pH

3、為2時(shí)仍保留50％的活性。表明OPA對(duì)高溫，對(duì)酸性環(huán)境表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。 295nm激發(fā)時(shí)，天然OPA的最大熒光發(fā)射峰在328nm處，比游離Trp的最大熒光發(fā)射峰348nm藍(lán)移了20nm，說(shuō)明Trp周?chē)臉O性較弱，位于相對(duì)疏水區(qū)，并未完全暴露于周?chē)軇┲小?80nm激發(fā)時(shí)，其最大熒光發(fā)射峰在340rim處，熒光強(qiáng)度增加，說(shuō)明OPA的內(nèi)源熒光發(fā)生了從Tyr到Trp的能量轉(zhuǎn)移。 研究了氯化銫，碘化鉀，丙烯酰胺和琥珀酰亞胺對(duì)

4、OPA的熒光粹滅作用，丙烯酰胺和琥珀酰亞胺對(duì)OPA中Trp淬滅程度達(dá)100％，KI淬滅約62.5％的Trp熒光，而氯化銫基本不能淬滅OPA的熒光，表明幾乎所有的色氨酸位于凝集素近分子表面相對(duì)疏水的淺溝或強(qiáng)陽(yáng)離子區(qū)域。 用熒光光譜法研究了變性劑脲，鹽酸胍和SDS在不同濃度下對(duì)OPA構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度逐漸增加時(shí)，熒光強(qiáng)度急劇增強(qiáng)。脲、鹽酸胍、SDS對(duì)凝集素凝血活性的影響表明，脲對(duì)OPA的活性沒(méi)有太大的影響。而隨著變性劑鹽酸胍、SDS濃

5、度的升高，凝血活性逐漸喪失。 NBS修飾Trp過(guò)程中，熒光強(qiáng)度明顯降低，最大發(fā)射波長(zhǎng)開(kāi)始沒(méi)有明顯變化，隨著Trp不斷被修飾，發(fā)射峰明顯藍(lán)移。計(jì)算表明大約有1個(gè)色氨酸殘基位于OPA分子表面，對(duì)凝血活性有一定的影響。用2，3-butanedione修飾精氨酸結(jié)果表明，對(duì)其修飾后導(dǎo)致凝血活性喪失70％，精氨酸修飾在'維持凝血活性中心或分子構(gòu)象中起著一定的作用。用DEPC修飾組氨酸以及用NBSF修飾酪氨酸，修飾后OPA凝血活性均沒(méi)有變化