藠頭凝集素蛋白的分離純化、克隆表達(dá)及其抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、凝集素是一類具有一個或多個可與單糖或寡糖可逆特異性結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在動物、植物和微生物中廣泛存在。植物凝集素在病原菌防御、細(xì)胞識別、細(xì)胞生長控制、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生理生化現(xiàn)象中具有重要作用。
　　 本文以傳統(tǒng)的藥食兩用蔥屬植物——藠頭(Allium chinense)為材料，通過分離純化得到一種藠頭凝集素(Allium chinense lectin，ACL)蛋白，并進(jìn)行了鑒定、克隆和重組表達(dá)及抗腫瘤活性研究。

2、r>　　 采用磷酸緩沖液(PBS，pH7.3)對研磨的新鮮藠頭鱗莖進(jìn)行抽提，飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行粗分離，然后經(jīng)Q Sepharose強(qiáng)陰離子交換色譜和Superdex200葡聚糖凝膠色譜分離得到SDS-PAGE單一條帶蛋白，質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示該蛋白可能為一種甘露糖結(jié)合凝集素。血凝活性研究表明ACL對兔血紅細(xì)胞凝集活性高，熱穩(wěn)定性較好，在極端酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，且僅有甘露糖對ACL的凝集作用具有抑制效果。
　　 Trizol法提取藠

3、頭總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA為模板，根據(jù)已知蔥屬植物凝集素基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得約320 bp片段，參照hiTAIL-PCR方法擴(kuò)增其側(cè)翼序列，根據(jù)所得3’端和5’端序列設(shè)計(jì)特異引物，PCR獲得該基因ORF序列，共456 bp，編碼151個氨基酸。根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列，可知ACL中包含3個已知的甘露糖結(jié)合位點(diǎn)QDNY，進(jìn)一步驗(yàn)證ACL為甘露糖特異性結(jié)合凝集素。利用BLAST對核苷酸和氨基

4、酸序列分別進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果顯示，該基因與其它凝集素核苷酸序列同源性介于76％-91％，氨基酸序列同源性在47％-89％。本研究構(gòu)建了大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ACL并轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，成功得到ACL融合蛋白，HisTrap親和色譜純化融合蛋白，免疫家兔制備多克隆抗體，為深入研究ACL與腫瘤細(xì)胞的相互作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
　　 天然和重組ACL分別作用于人肝癌細(xì)胞(Hep-3B)和人臍帶靜脈內(nèi)皮

5、細(xì)胞(HUVEC)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，native-ACL和recombinant-ACL都能明顯抑制Hep-3B細(xì)胞增殖、降低腫瘤細(xì)胞活性，且native-ACL對HUVEC細(xì)胞增殖無顯著影響。DNA片段化實(shí)驗(yàn)中，native-ACL處理組Hep-3B細(xì)胞DNA在瓊脂糖凝膠檢測時出現(xiàn)明顯“梯狀”條帶。經(jīng)DAPI、tubulin Alexa Fluor488和Mito TrackerRed CMVRos分別對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色后在激

6、光共聚焦顯微鏡下檢測，結(jié)果顯示native-ACL處理后Hep-3B細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)上都發(fā)生了變化:細(xì)胞皺縮成圓形，細(xì)胞核呈現(xiàn)多形化，微管蛋白凝聚導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞，線粒體跨膜電位出現(xiàn)崩解。而native-ACL處理HUVEC細(xì)胞和未處理的陰性對照組細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架等都沒有明顯差異。同時，利用anti-ACL一抗和熒光染料偶聯(lián)的二抗對native-ACL在細(xì)胞中的定位進(jìn)行，結(jié)果表明在ACL處理后的細(xì)胞胞漿中熒光明顯，說明native-AC