利用定向進(jìn)化技術(shù)提高米黑霉脂肪酶活性和耐熱性的研究.pdf

1、脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦稱?；视退饷?，在糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)等許多領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。其中米黑霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase，RML，基因編號:A34959)是一種能夠?qū)Ｒ恍运飧视腿?，3位酯鍵的脂肪酶，水解得到的二酯和單酯在工業(yè)中具有更廣泛的應(yīng)用價值。
　　 天然的RML包括24個氨基酸組成的信號肽，70個氨基酸組成的前導(dǎo)肽，以及269個氨基酸組成的成熟蛋白。成熟蛋白的理

2、論相對分子質(zhì)量為31.6 kD。本課題的研究對象僅包括前導(dǎo)肽和成熟區(qū)。研究首次利用大腸桿菌原核表達(dá)體系對目的基因進(jìn)行高效表達(dá)。通過3種方式提高了RML在大腸桿菌中可溶性蛋白的表達(dá)量:1.低溫誘導(dǎo)(16℃)RML表達(dá);2.新型分子伴侶(Skp)與RMLN端融合表達(dá);3.載體pET32a上的Trx· tag與RMLN端融合表達(dá)。研究證明低溫誘導(dǎo)RML的表達(dá)效果最好，蛋白表達(dá)量是37℃誘導(dǎo)結(jié)果的5.4倍，說明誘導(dǎo)溫度是影響可溶性蛋白表達(dá)量的關(guān)

3、鍵因素。
　　 前導(dǎo)肽是一類能夠幫助其相連蛋白正確折疊的多肽，課題首次發(fā)現(xiàn)RML在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)后，其前導(dǎo)肽不被切去。而若在克隆過程中人為去掉前導(dǎo)肽序列后，RML在大腸桿菌體內(nèi)沒有表達(dá)。這一現(xiàn)象說明RML的前導(dǎo)肽對其成熟蛋白的正確折疊具有重要作用，并指出在后續(xù)對RML進(jìn)行改造的研究中應(yīng)以包括前導(dǎo)肽的RML全蛋白為研究對象。
　　 提高脂肪酶的催化比活力，是降低脂肪酶生產(chǎn)成本的有效途徑之一。研究在RML全蛋白結(jié)構(gòu)未知的前

4、提下，首先采取易錯PCR方式引入隨機(jī)突變，再通過有效的高通量篩選方法挑出理想的突變體;其次，通過對RML前導(dǎo)肽與成熟區(qū)域折疊方式的正確分析，得出RML成熟區(qū)域是相對于前導(dǎo)肽獨(dú)立折疊的結(jié)論，其空間結(jié)構(gòu)(PDB:3TGL)可作為蛋白改造的參考依據(jù);最后，參考RML成熟蛋白結(jié)構(gòu)，對易錯PCR得到的突變位點(diǎn)進(jìn)行篩選，再通過定點(diǎn)突變和飽和突變持續(xù)提高RML的活性和耐熱性。據(jù)此，研究充分利用定向進(jìn)化的各種策略對酶進(jìn)行成功的改造，共包括4輪易錯PCR

5、、2次定點(diǎn)突變和4輪飽和突變。不僅使RML水解甘油三酯的活性得到明顯提高，還使其耐熱性得到改良。研究共挑選出15株理想突變體，其中M13(D48V/V67A/S168P/S240V/S311 C/D313H)的比活可達(dá)到3609±100U/mg，為野生型RML水解活性的14.3倍;而M15(D48V/V67A/S168P/S240A/S311C/D313H)具有最理想耐熱性，其經(jīng)70℃兩小時熱處理后，保留活性達(dá)1316±50U/mg，而

6、這一數(shù)值是野生型RML不經(jīng)熱處理水解活性的5.2倍。高活性和高耐熱性的酶對于工業(yè)的應(yīng)用更為廣泛。因此，在利用定向進(jìn)化技術(shù)對酶進(jìn)行改造的設(shè)計中，不能僅局限于一種方式，而多角度結(jié)合，利用“半理性設(shè)計”思想才會有更好的效果。
　　 本課題還首次研究了前導(dǎo)肽在脂肪酶定向進(jìn)化中的作用。盡管前導(dǎo)肽的作用被普遍認(rèn)為是幫助其相連蛋白的正確折疊，RML的前導(dǎo)肽和成熟蛋白在空間構(gòu)象上也是相互獨(dú)立折疊的兩部分，然而RML定向進(jìn)化結(jié)果仍有力指出前導(dǎo)肽的

7、突變提高了目的蛋白的水解活性。通過對源于脂肪酶家族23段前導(dǎo)肽序列的二級結(jié)構(gòu)比對分析，發(fā)現(xiàn)前導(dǎo)肽的N末端和C末端多以疏水性氨基酸為主，并且RML前導(dǎo)肽的突變也多集中于N末端或C末端，并趨向于疏水性氨基酸的突變。這一結(jié)果顯示:RML前導(dǎo)肽的突變向著有利于其自身折疊過程中形成“穩(wěn)定內(nèi)核”的方向發(fā)展，這有利于幫助RML成熟區(qū)更“完美”的折疊，進(jìn)而影響其比活。因此，高活性的突變體是在RML前導(dǎo)肽和成熟區(qū)的協(xié)同作用下，共同進(jìn)化的結(jié)果。前導(dǎo)肽的進(jìn)化