29924.分子突變改善擴(kuò)展青霉脂肪酶的耐熱性

1、摘要摘要擴(kuò)展青霉脂肪酶(PEL)可在油水界面催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油，是‘工業(yè)生產(chǎn)上一種重要的水解酶。本研究利用疊加突變技術(shù)手段，對擴(kuò)展青霉脂肪酶(PenicilliumexpansumlipasePEL)進(jìn)行熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)工程改造。ep8是由本課題組前期獲得的含有一個(gè)突變點(diǎn)的擴(kuò)展青霉脂肪酶隨機(jī)突變體，其熱穩(wěn)定性比野生型有所提高。作者以ep8為模板，利用重疊延伸PCR構(gòu)建了pPIC35Kep8K56R、pPIC35Kep8一P

2、90D、pPIC35K—ep8一E207P、pPIC35K—ep8E221P、pPIC35Kep8K226A、pPIC35Kep8一P82D、pPIC35Kep8E113P、pPIC35Kep8一1164S、pPIC35Kep8一K115P、pPIC35Kep8S139R、pPIC35Kep8N157Y、pPIC35Kep8K56RKI15R等突變基因表達(dá)載體。將這些攜帶突變基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GSll5，獲得了12種含有突變基

3、因的脂肪酶基因工程菌：PELep8K56RGS、PELep8P90DGS、PELep8E207PGS、PELep8一E221PGS、PELep8一K226AGS、PELep8P82DGS、PELep8El13PGS、PELep8一1164S—GS、PELep8一Kll5PGS、PELep8S139RGS、PELep8N157YGS、PELep8K56RK115RGS。通過平板、搖瓶發(fā)酵并在甲醇的誘導(dǎo)下進(jìn)行突變脂肪酶表達(dá)，突變脂肪酶的溫度

4、適宜性和熱穩(wěn)定性，結(jié)果顯示：PELep8一K56R、PEL—ep8一P90D、PEL—ep8一E207P，PELep8一E221P，PEL—ep8一K226A，PEL—ep8一P82D，PELep8Ell3P、PEL—ep8一1164S、PELep8K115P、PEL—ep8一S139R、PELep8N157Y、PELep8K56RK115R等12個(gè)疊加突變體中，(1)疊加突變體PELep8K56R的最適作用溫度為37“(2，比野生型脂

5、肪酶PEL的最適作用溫度下調(diào)了3“C，熱穩(wěn)定性(m)比野生型提高了14。C，比隨機(jī)突變體PELep8提高了O2℃。發(fā)酵酶活約為852U／ml，是一個(gè)熱穩(wěn)定性獲得一定提高的突變體。(2)疊加突變體PELep8P90D最適作用溫度比野生型PELGS降低6“C，Tm比隨機(jī)突變體PELep8低O8℃，比野生型高01℃；發(fā)酵酶活約為584U／mL。(3)疊加突變體PELep8K56RK115RGS的‰值為375“C，比野生型下降了25℃；發(fā)酵酶活

6、約為56U／mL。(4)疊加突變體PELep8E207P、PELep8E221P、PELep8K226A、AbstractAbstractPenicilliumexpansumlipase(PEL)playsanimportantroleincommercialproductionforitscatalyzehydrolysisfunctionInordertoimprovingthethermostabilityofthePEL，th

7、elipaseencodinggenewasmutatedbysitedirectedmutagenesisSeveralrecombinantvetorswhichcontaindoubleortriplemutantgeneswereconstructedbyoverlapextensionPCRusingthecDNAofarandom—mutantlipaseep8(asinglesitemutant)asthetemplate

8、andtwospecialprimerswereusedtogeneratemutationsiteTherecombinantvectorsweretransformedintoPichiapastorisGSll5byelectroporationandcorrespondingrecombinantexpressioncellsPELep8一K56RGS、PELep8K56RGS、PELep8P90D—GS、PEL—ep8一E20

9、7PGS、PEL—ep8一E221PGS、PELep8K226AGS、PELep8P82DGS、PELep8一Ell3P—GS、PELep8I164SGS、PELep8一Kll5P—GS、PELep8S139RGS、PEL—ep8N157YGS、PELep8一K56RK115RGSwerecreatedThecorrespondingmutantlipasePELep8K56R、PEL—ep8一P90D、PELep8一E207P、PEL

10、ep8E221P、PELep8K226A、PEL—ep8P82D、PEL—ep8Ell3P、PELep8一1164S、PELep8一Kll5P、PELep8S139R、PEL—ep8N157Y、PELep8K56RK115Rwereobtainedbyflaskshakingandthethermostabilityofthesemutantlipasesweremeasured(1)TheTmofPEL—ep8一K56Ris401℃，

11、14“Chigherthanthatofwildtypelipaseand02℃higherthanthatofrandommutantlipaseTheexpressionlevelofthedoublemutantlipaseis852U／mL(2)TheTmofPELep8P90Dis388“C，whichisclosetowildtypelipaseTheexpessionisabout584U／mL(3)TheTmoftrip

12、lemutantPELep8K56RK115Ris375“C，25“12lowerthanthatofwildtypelipaseTheexpressionlevelis56U／mL(4)Otherdouble—mutantsPELep8一E207P、PEL—ep8一E221P、PEL—ep8K226A、PELep8P82D、PEL—ep8一Ell3P、PEL—ep8一1164S、PELep8一Kll5P、PELep8S139R及PEL