短小芽胞桿菌脂肪酶YZ02的定向進化研究.pdf

1、定向進化是蛋白質(zhì)工程的新策略，屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計。它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機理，而是人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外改造酶分子結(jié)構(gòu)并定向選擇出具有目的性狀的改良酶。常用的進化策略包括易錯PCR、交錯延伸重組和DNA改組等。
　　 本研究以自主克隆到的短小芽胞桿菌脂肪酶YZ02基因為材料，利用易錯PCR技術(shù)對其開展了體外定向進化研究。共進行了兩輪易錯PCR，每輪約篩選6000個轉(zhuǎn)化子。共篩選出4株酶活

2、力提高2倍以上的突變體，其中一株突變體BpL2-1369酶活力提高了6倍。測序結(jié)果顯示，BpL2-1369脂肪酶基因有4個堿基發(fā)生了突變，即：T61C、C147T、A334G和T371A。其中3個堿基突變導致了氨基酸發(fā)生改變，分別為第21位氨基酸由Ser突變?yōu)镻ro，第112位氨基酸由Arg突變?yōu)镚ly，第124位氨基酸由Leu突變?yōu)镠is。在兩輪易錯PCR的基礎(chǔ)上，進行了一輪交錯延伸重組，但未能篩選到酶活力有進一步提高的重組體。將野生

3、型脂肪酶BpL基因和定向進化后的脂肪酶BpL2-1369基因分別克隆至pET28-a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞。經(jīng)IPTG誘導表達并分離純化后，對脂肪酶的酶學性質(zhì)進行了比較研究。結(jié)果顯示，突變脂肪酶BpL2-1369的比活力比野生型脂肪酶BpL提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.17mmol/L，在pH>8.0時的穩(wěn)定性較野生型脂肪酶有所提高，但pH<8.0時的穩(wěn)定性卻有所降低。在上述研究的基礎(chǔ)上，對B.