N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其殼聚糖納米材料固定化酶抗細(xì)菌生物被膜作用研究.pdf

1、細(xì)菌生物被膜是指由細(xì)菌和由細(xì)菌自身所分泌的包裹著細(xì)菌的胞外基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落,其中胞外多糖(EPS)作為基質(zhì)的主要成分之一參與了細(xì)菌的初始粘附,成熟的生物被膜結(jié)構(gòu)形成等。研究表明,金黃色葡萄球和表皮葡萄球菌生物被膜中重要多糖成分是β-1,6-N-乙酰氨基葡糖胺。實(shí)驗(yàn)室先期研究中發(fā)現(xiàn)的β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶Nag1,可以專一降解β-1,6-N-乙酰氨基葡糖胺。本文系統(tǒng)研究了Nag1對革蘭氏陽性菌(主要是葡萄球菌)生物被

2、膜形成的作用,并利用羧甲基殼聚糖(carboxymethyl-chitosan,CMCS)納米材料對酶進(jìn)行固定化,研究了固定化酶的相關(guān)性質(zhì)。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先利用多種體外生物被膜模型,包括96孔靜態(tài)模型、flow cell動態(tài)模型,并以臨床常用氯乙烯導(dǎo)管、氯乙烯膜片和導(dǎo)尿管為材料構(gòu)建了相關(guān)的模型,評價了Nag1對細(xì)菌生物被膜形成的作用。實(shí)驗(yàn)表明,在96孔板模型中Nag1對9種葡萄球菌的生物被膜形成均有抑制效果。當(dāng)Nag1的終濃度

3、為0.3 U/mL時,其對生物被膜形成的抑制率達(dá)到80％以上。同樣,在flow cell和氯乙烯導(dǎo)管模型中,Nag1也能顯著抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。在臨床使用的氯乙烯膜片與導(dǎo)尿管等模型中,Nag1對表皮葡萄球菌生物被膜形成的抑制率分別達(dá)到76％和72％。
　　 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明Nag1對于已形成的細(xì)菌生物被膜亦具有明顯的清除作用,當(dāng)Nag1終濃度達(dá)到0.3 U/mL時,其對靜態(tài)模型生物被膜的清除率達(dá)到80％以上,而對于動

4、態(tài)模型下的生物被膜清除率則達(dá)90％以上。Nag1對形成于醫(yī)用材料氯乙烯膜片與導(dǎo)尿管上的生物被膜清除效果分別為79％和76％。
　　 細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的物理屏障,為了確定Nag1是否能增強(qiáng)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的抗生素敏感性,測定了氨芐青霉素單獨(dú)以及其與Nag1聯(lián)合條件下,不同菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最低殺菌濃度(minimal bactericidal

5、concentration,MBC)及最低生物被膜清除濃度(minimum biofilm eliminating concentration,MBEC)。結(jié)果表明,10株受試菌株形成生物被膜后對氨芐青霉素的抵抗能力有不同程度的提高(16-512倍),Nag1不能改變浮游菌的抗生素敏感性但是可以增強(qiáng)生物被膜菌的氨芐青霉素敏感性(MBEC降低8-64倍)。
　　 為了檢測Nag1在動物模型上的作用效果,本實(shí)驗(yàn)成功建立了金黃色葡萄球

6、菌小鼠燙傷生物被膜模型并將Nag1作用于感染處,結(jié)果顯示Nag1可有效抑制并清除感染處的生物被膜。Nag1與抗生素聯(lián)用可明顯提高抗生素的作用效果。
　　 由于溶液酶存在穩(wěn)定性差、不能反復(fù)利用等缺陷,本實(shí)驗(yàn)以羧甲基殼聚糖納米粒為載體,研究了Nag1固定化酶的活力并對影響酶活力的因素包括溫度、儲存穩(wěn)定性等進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,固定化提高了酶的穩(wěn)定性,同時固定化酶重復(fù)操作8次后,仍有63％的活性,表明固定化酶適于酶的回收與反復(fù)利用

7、。在細(xì)菌生物被膜形成方面,固定化酶對生物被膜的抑制效果和清除效果均優(yōu)于溶液酶。
　　 實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),固定化酶的材料羧甲基殼聚糖本身也具有抗生物被膜效果,因此本文深入研究了羧甲基殼聚糖對生物被膜的影響。在96孔板模型和動態(tài)模型下,CMCS可以有效抑制革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌生物被膜的形成。在初始黏附階段CMCS對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑制率均大于90％,而其對生物被膜菌細(xì)胞與細(xì)胞之間聚集能力的抑制率分別為63％和71％。在作

8、用機(jī)制方面CMCS并不能影響細(xì)菌生長,而是導(dǎo)致細(xì)菌絮凝,其對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的絮凝指數(shù)分別為17％和25％。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CMCS對細(xì)菌絮凝作用是由于CMCS帶有的正電荷中和了細(xì)菌表面的負(fù)電荷,另外推測CMCS本身的吸附架橋作用也可促進(jìn)絮凝。
　　 綜上所述,Nag1在不同模型中均具有良好的生物被膜形成抑制作用和清除作用;固定化提高了酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)了酶的活力,有利于酶的重復(fù)利用;羧甲基殼聚糖自身亦具有良好的抗細(xì)菌生物