N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其對伴放線放線桿菌生物膜作用的研究.pdf

1、生物膜(biofilm)是由細菌和其分泌的胞外基質在物體表面形成的高度組織化的多細胞結構。一旦形成生物膜，細菌將具有極強的抗生素耐藥性(比浮游細菌高100～1000倍)和逃避機體免疫系統攻擊的能力。生物膜無處不在，在很多方面給人類生活帶來嚴重的影響。根據美國NIH的調查公告，80％以上的細菌性感染與生物膜有關。由于傳統的抗菌藥物對細菌生物膜幾乎沒有作用，因此，如何防治細菌生物膜已成為人類面臨的巨大挑戰(zhàn)。 牙菌斑生物膜是牙周病的

2、始動因素，在牙茵斑生物膜的刺激下，牙周組織細胞分泌的細胞因子在牙槽骨吸收及牙周軟組織破壞的過程中發(fā)揮著重要作用。然而，目前絕大多數研究集中在浮游細菌對牙周組織細胞毒性的研究，而關于細菌生物膜與牙周病的研究極少。胞外多糖是細菌生物膜的主要成分，它決定了生物膜的結構和功能。最新研究表明，伴放線放線桿菌是侵襲性牙周炎的主要致病菌，它產生的β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺是其生物膜的主要成份，在生物膜形成和致病性方面發(fā)揮著重要作用。因此，本論文旨在

3、從海洋微生物中篩選降解β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺的多糖水解酶，并研究其抗牙菌斑細菌生物膜的作用。 以β-l，6-N-乙酰葡聚糖胺為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，從黃海海泥樣品中篩選到一株高產N-乙酰葡萄糖苷酶的菌株。經16S rRNA技術鑒定，該菌株被鑒定為假交替單胞菌屬，命名為假交替單胞菌(Pseudoal teromonas sp.)QY403。 利用硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析技術，從菌株QY403的發(fā)酵

4、液上清中分離純化到一種N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1。該酶的分子量為40.2 kD；酶反應的最適pH為6.0，pH穩(wěn)定范圍為5.0～7.2；最適反應溫度為40℃，酶的活性在0～40℃之間基本穩(wěn)定； Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Fe2+、Fe3+、EDTA對于酶的活性有促進作用，而Cu2+、Ni2+對于酶的活性有抑制作用，SDS可以使酶完全失去活性。酶的底物專一性分析結果表明該酶能特異性降解β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺。

5、 在上述研究的基礎上，本文進一步研究了N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1的抗A.a生物膜作用，并且從細胞因子產生的角度觀察了NagY1對A.a致病性的影響。首先，利用A.a的體外生物膜模型，評價了不同濃度的NagY1對A. a生物膜形成的抑制作用和對已形成生物膜的清除作用。結果顯示，NagY1對A.a生物膜形成具有顯著的抑制作用(>50％)，并且對已形成生物膜的清除率為74.5％(P<0.05)。其次，研究了A.a生物膜刺激對人牙周韌帶細胞

6、產生細胞因子RANKL、IL-6、IL-1 B、IL-8、IFN-Y的影響以及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶降解A.a生物膜對牙周韌帶細胞產生細胞因子的影響。將A.a生物膜與原代培養(yǎng)的人牙周韌帶細胞共培養(yǎng)0-9h，用實時熒光定量PCR技術檢測人牙周韌帶細胞的細胞因子mRNA的表達量，分別與浮游A.a刺激組以及空白對照組進行比較分析。實驗結果顯示，A.a生物膜和浮游菌刺激均可以提高人牙周韌帶細胞的IL-1β、IL-8、IFN-YmRNA表達量；A

7、.a生物膜比A.a浮游菌具有更強地刺激人牙周韌帶細胞產生細胞因子RANKL、 IL-6、IL-1β、IL-8、IFN-Y mRNA的作用(P<0.05)。N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1降解A.a生物膜，使A.a生物膜刺激細胞人牙周韌帶細胞產生細胞因子mRNA表達量較明顯降低。 綜上所述，本論文篩選得到一株高產N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的海洋交替假單胞茵，并從其發(fā)酵上清液中成功地分離純化了一種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1：NagY