鋸緣青蟹內(nèi)表皮N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性質(zhì)研究.pdf

1、以鋸緣青蟹(Scylla serrata)內(nèi)表皮為材料，經(jīng)過含0.2 mol/L NaCl的10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液勻漿抽提處理，硫酸銨分級(jí)鹽析純化，獲得粗酶。粗酶再經(jīng)過SephadexG-100凝膠層析，DEAE-Cellulose離子交換柱層析，Phenyl Sepharose柱層析，及ConA Sepharose柱層析，獲得比活為668.90 U/mg的聚丙烯酰胺凝膠電泳單一純N-乙酰-β-D-氨基葡

2、萄糖苷酶(N-Acetyl-β-D-glucosaminidase或NAGase，EC3.2.1.52)制劑。通過Sephacryl-S200凝膠過濾柱層析法測定該酶的分子量約為74.59 kD。該酶為糖蛋白。 進(jìn)一步對(duì)鋸緣青蟹內(nèi)表皮NAGase進(jìn)行研究?；瘜W(xué)修飾法研究表明：組氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基和酸性氨基酸的側(cè)鏈羧基是該酶的活性功能基團(tuán)，而二硫鍵、賴氨酸的ε-氨基和精氨酸胍基不是該酶所必需的。 分別選用水體污染

3、物(金屬離子和有機(jī)溶劑)、飼料成分(氨基酸和糖)及抗菌類藥物為效應(yīng)物，探討這些物質(zhì)對(duì)內(nèi)表皮NAGase活力的影響。 1．金屬離子對(duì)酶活力的影響：結(jié)果表明Mg2+對(duì)酶活力幾乎沒有影響；Co2+和Mn2+分別在1.0-10.0 mmol/L和0.5-20.0 mmol/L濃度范圍對(duì)酶有輕微的激活作用；Al3+對(duì)酶有一定的抑制作用，當(dāng)其濃度為0.54 mmol/L時(shí)，可抑制44.4％的活力；而Pb+、Cu2+和Zn2+對(duì)酶具有強(qiáng)烈的抑

4、制作用，其半抑制濃度(IC50)分別為：0.4、0.05和0.04 mmol/L。 2．有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響：結(jié)果表明甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、丙酮、甲醛、二甲亞砜、二氧六環(huán)及二甲基甲酰胺等對(duì)酶均有較強(qiáng)的抑制作用，其半抑制濃度(IC50)分別為：3.7、2.3、1.15、2.4、2、2.3、0.80、1.15、0.68、0.88和0.8mol/L。 3．氨基酸對(duì)酶活力的影響：結(jié)果表明除L-Lys具有明顯

5、的抑制作用，L-His和L-Asp具有輕微的抑制作用外，其余的幾種氨基酸對(duì)該酶均無明顯的影響。導(dǎo)致該酶活力喪失一半的L-Lys濃度(IC50)為11 mmol/L。 4．糖對(duì)酶活力的影響：結(jié)果表明當(dāng)鼠李糖(rha)的濃度達(dá)0.2 mol/L，可激活酶活力約15％；0.8 mol/L的果糖(fru)、蔗糖(suc)、葡萄糖(glvu)和甘露糖(man)分別使酶的活力下降47.61％、57.54％、85.70％和90.50％；0.6

6、 mol/L的阿拉伯糖(ara)可抑制酶41.62％的活力；0.09 mol/L的葡萄糖醛酸(glcUA)可使酶活力基本喪失；0.3 mol/L的半乳糖(gal)可抑制酶活力37.71％；而80 mmol/L的NAG可使酶喪失83％的活力。 5．抗菌類藥物對(duì)酶活力的影響：結(jié)果表明青霉素鉀、卡那霉素和鏈霉素對(duì)酶活力基本沒有影響；1.0—10.0 mg/ml的慶大霉素對(duì)酶有輕微的激活作用；而恩諾沙星對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用，使酶活力喪失

7、一半的濃度(IC50)為2.9 mg/ml。 分別以鋸緣青蟹的內(nèi)表皮和肝胰臟為材料，通過勻漿、離心，獲chtitnase和NAGase粗酶液。通過對(duì)不同生長期鋸緣青蟹chitinase和NAGase的比較研究，結(jié)果顯示不同生長期鋸緣青蟹內(nèi)表皮的chitinase和NAGase的比活力變化趨勢(shì)基本一致：比活力在第1期最高，然后依次遞減，第5期達(dá)到最低，此后維持在一穩(wěn)定的水平。而肝胰臟chitinase和NAGase的比活力變化趨勢(shì)

8、雖然基本一致，但并沒有一定的變化規(guī)律。內(nèi)表皮和肝胰臟的NAGase最適pH都在5.6—5.8，最適溫度分別為42℃和40±2℃，pH穩(wěn)定性分別是5.0—10.0和5.0—9.0。溫度穩(wěn)定性方面的研究表明內(nèi)表皮NAGase在大于45℃的條件下活力逐漸喪失，肝胰腺NAGase在大于42℃．的條件下活力開始降低。 通過對(duì)不同季節(jié)鋸緣青蟹chitinase和NAGase的比較研究，結(jié)果表明：鋸緣青蟹內(nèi)表皮chitinase和NAGase

9、活力表現(xiàn)一致的季節(jié)性變化趨勢(shì)，活力較高的月份集中在10—12月；一年當(dāng)中，3月的活力較低，此后活力逐漸升高，直至11月，活力達(dá)到最高，然后又逐漸減小。不同季節(jié)肝胰臟chitinase和NAGase的活力變化規(guī)律與與內(nèi)表皮的相似。不同季節(jié)NAGase的基本酶學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，內(nèi)表皮和肝胰腺的NAGase最適pH都在5.6—5.8，最適溫度分別為42℃和40±2℃，pH穩(wěn)定性分別是5.0—10.0和5.0—9.0。溫度穩(wěn)定性方面的研究表明內(nèi)表皮