鋸緣青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、以鋸緣青蟹(ScyllaSerrata)內(nèi)臟為材料，通過(guò)含0.2mol/LNaCl的0.01mol/L，Tris—HCl(pH7.5)緩沖液抽提、硫酸銨分級(jí)沉淀、SephadexG—100凝膠柱過(guò)濾層析、DE—32離子交換柱層析，分離提純NAGase(NAGase)，獲得比活力為7，990U/mg的電泳單一純NAGase制劑(NAGase，EC3.2，1.52)。本文以此酶制劑為對(duì)象展開(kāi)以下幾方面的研究。 研究過(guò)氧化氫對(duì)鋸緣青蟹

2、NAGase活力的影響及抑制動(dòng)力學(xué)。其結(jié)果表明，過(guò)氧化氫對(duì)該酶有顯著的抑制作用，隨著過(guò)氧化氫濃度的增高，酶活力呈指數(shù)下降，測(cè)出可使酶活力下降50％的過(guò)氧化氫濃度(抑制半衰期，IC50)為0.115mol/L。低濃度過(guò)氧化氫對(duì)該酶的抑制過(guò)程顯示為可逆效應(yīng)。采用底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法研究過(guò)氧化氫對(duì)該酶的抑制作用動(dòng)力學(xué)、建立動(dòng)力學(xué)模型，測(cè)定游離酶(E)和酶—底物絡(luò)合物(ES)的微觀抑制速度常數(shù)k+0和k'+0并加以比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(k+0＞k'+0

3、)表明底物對(duì)酶被過(guò)氧化氫的抑制作用有一定的保護(hù)作用。過(guò)氧化氫可能是通過(guò)氧化酶活性中心功能基團(tuán)而導(dǎo)致酶活性的喪失。該研究對(duì)了解NAGase的功能基團(tuán)性質(zhì)及酶的催化作用機(jī)理提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究脲對(duì)酶的效應(yīng)，結(jié)果表明，脲對(duì)鋸緣青蟹N—乙?！隆狣—氨基葡萄糖苷酶(NAGase)有失活作用，隨著脲濃度的增大，酶活力呈指數(shù)下降，測(cè)定導(dǎo)致酶活力下降50％的脲濃度(失活半衰期，IC50)為0.63mol/L。酶在脲溶液中的失活過(guò)程顯示為

4、可逆失活。用底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法考察酶在脲溶液中的失活動(dòng)力學(xué)，測(cè)定游離酶(E)和酶—底物絡(luò)合物(ES)在脲溶液中失活的微觀速度常數(shù)，并比較游離酶(E)和酶—底物絡(luò)合物(ES)的正向反應(yīng)的微觀失活速度常數(shù)，表明底物存在對(duì)酶被脲的失活作用有一定的保護(hù)作用。正向的失活速度常數(shù)k+0和k'+0隨著脲濃度的增大而增大，而逆向的速度常數(shù)k—0隨著脲濃度的增大而減小。表明隨著脲濃度的增大，酶變性越來(lái)越快，而活力恢復(fù)越來(lái)越難。 研究十六種氨基酸對(duì)

5、酶的效應(yīng)，結(jié)果表明：非極性氨基酸中Gly、Ala、leu、Phe對(duì)酶活力幾乎沒(méi)有作用，Val、Ile對(duì)酶略有激活，Val濃度為20mmol/L使酶活力提高7.5％，Ile濃度為40mmol/L，使酶活力提高10.5％。Pro，Met對(duì)酶活力略有抑制作用，當(dāng)Pro濃度為40mmol/L時(shí)分別使酶活力下降15.2％，當(dāng)Met濃度為40mmol/L時(shí)分別使酶活力下降9.8％。極性氨基酸Asn、Cys、Ser、Thr對(duì)酶的活力沒(méi)有影響。帶負(fù)電荷

6、的酸性氨基酸Asp和Glu對(duì)酶有抑制作用，當(dāng)Asp濃度為40mmol/L時(shí)，使酶活力下降38％；當(dāng)Glu濃度為40mmol/L時(shí)，可使酶活力下降25％。帶正電荷的堿性氨基酸His略有抑制，Lys和Arg抑制作用較強(qiáng)，研究Lys和Arg對(duì)酶催化pNP—NAG水解反應(yīng)的抑制機(jī)理，并測(cè)定其抑制常數(shù)，結(jié)果表明Lys和Arg的對(duì)酶的抑制均表現(xiàn)為可逆效應(yīng)，抑制類型均為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制，其Kis分別為5.29mmol/L和3.76mmol/L。

7、研究對(duì)—氯汞苯甲酸(pCMB)對(duì)NAGase的化學(xué)修飾作用，巰基是酶活性的必須基團(tuán)。氯化汞對(duì)鋸緣青蟹NAGase抑制動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果證明：當(dāng)汞離子濃度小于1.0μmol/L時(shí)，汞離子對(duì)剩余酶活力的作用表現(xiàn)為可逆反應(yīng)，汞離子對(duì)酶的抑制機(jī)理屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型。通過(guò)汞離子對(duì)酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)模型的建立，測(cè)定游離酶(E)和酶．底物絡(luò)合物(ES)在氯化汞溶液中失活的微觀速度常數(shù)，研究汞離子濃度與表觀速度常數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果證明：僅一分子氯化汞結(jié)合