Bc幾丁質酶表達類型檢測及chiB基因上游DR的功能分析.pdf

1、多種芽胞桿菌都可產生幾丁質酶(chitinase，簡稱Chi)。但芽胞桿菌幾丁質酶的表達方式及調控機制目前尚無定論。本研究首先對實驗室保藏的26株蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus，簡稱Bc)在基礎培養(yǎng)基和誘導培養(yǎng)基分別進行培養(yǎng)后，測定上清幾丁質酶活性，比較分析不同培養(yǎng)基中的酶活數(shù)值，確定菌株表達量及不同表達類型所占比例。發(fā)現(xiàn)50％的菌株檢測不到酶活，而在產酶菌株中，76%屬于誘導型，23%屬于組成型。證明蠟狀芽胞桿菌幾丁質酶

2、的表達方式具有多態(tài)性。
　　 通過對保守區(qū)域進行PCR，檢測了Bc菌株中幾丁質酶基因的分布。發(fā)現(xiàn)所有Bc菌株中都含有至少一種Chi編碼基因，ChiA與chiB的陽性率分別達到80.8%和96.2%，且兩種基因同時存在的占總數(shù)的76.9%。證明蠟狀芽胞桿菌幾丁質酶基因廣泛存在。在這一結果的基礎上，利用RFLP方法(RestrictionFragment Length Polymorphism)分析PCR檢測產物，發(fā)現(xiàn)大部分酶切片段

3、的遷移率與已知序列相同，不同Bc菌株該基因序列的同源性很高，說明chi基因在Bc基因組中相當保守。
　　 根據(jù)幾丁質酶表達類型及基因檢測結果，挑選酶活性最高且典型誘導型的菌株Bc53，以及典型的組成型菌株Bc49和Bc79，克隆包含調節(jié)區(qū)域在內的幾丁質酶基因。發(fā)現(xiàn)攜帶有chiB53基因的大腸桿菌異源表達的幾丁質酶也能夠明顯抑制小麥赤霉(Gibberella saubinetii)和黑曲霉(Aspergillus niger)孢子

4、的萌發(fā)，證明ChiB具有顯著的抑真菌活性。檢測chiB在E.coli和Bc9509異源表達類型，發(fā)現(xiàn)原組成型chiB49和chiB79在E.coli中仍為組成型表達，而原誘導型chiB53在兩種宿主中也均為組成型表達。測序及軟件分析后發(fā)現(xiàn)，前兩者的潛在啟動子區(qū)與組成型表達的蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)15A3菌株chiB基因相似性達到100%，而與誘導型chiB53的啟動子區(qū)有9個堿基的差異。

5、r>　　 利用軟件對已克隆的幾丁質酶基因上游調節(jié)序列進行分析，發(fā)現(xiàn)chiB53基因上游存在長度分別為lObp和8bp的兩對正向重復序列(direct repeat，DR)。該DR進行了部分及全部缺失，并從幾丁質酶活性、特異蛋白表達量以及mRNA豐度三個水平觀察缺失DR對基因表達的影響。結果顯示，缺失部分及全部重復序列后的3個△chiB基因轉化進E.coil，無論幾丁質酶活性、特異分子量的蛋白表達量，還是特異mRNA的轉錄水平均明顯提高

6、，證明DR是幾丁質酶基因在E.coli中異源表達的負控制元件，且這種調控發(fā)生在mRNA水平。
　　 將完整和一系列缺失DR的△chiB53上游調控區(qū)域與含有報告基因bgaB的穿梭載體pCB連接，轉入芽胞桿菌。缺失后，報告基因表達量的沒有明顯提升，說明正向重復序列對于chi基因在芽胞桿菌中的表達無顯著負調控作用。
　　 本研究為生防芽胞桿菌幾丁質酶的表達方式、生物防治菌種資源的開發(fā)應用，以及chi基因調控機理的探索提供了有