納豆菌篩選及其發(fā)酵產(chǎn)川芎嗪工藝研究.pdf

1、川芎嗪又名四甲基吡嗪,是吡嗪類(lèi)生物堿,具有多種藥理作用,但其制備方法——化學(xué)合成和直接提取都存在一定的不足,而微生物發(fā)酵法由于其產(chǎn)品綠色天然、成本低、環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。納豆菌(Bacillusnatto)是從納豆中分離出來(lái)的益生菌,能產(chǎn)生多種生理活性代謝物,也可發(fā)酵制備川芎嗪。因此利用納豆菌發(fā)酵制備川芎嗪具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本課題主要研究?jī)?nèi)容:納豆菌的分離純化、鑒定篩選;利用GC-MS技術(shù)分析超高壓處理對(duì)納豆香氣

2、成分的影響;通過(guò)HPLC檢測(cè)確認(rèn)發(fā)酵液中川芎嗪的存在并建立其檢測(cè)方法;最后以川芎嗪的含量為主要指標(biāo)對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。提供一種川芎嗪的生物制備方法,也為納豆菌的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。研究結(jié)論如下:
　　 (1)從納豆中分離純化得到三株菌株,經(jīng)鑒定均為納豆菌,以感官品質(zhì)為主要指標(biāo)篩選出適合發(fā)酵納豆的菌種NT-1,通過(guò)測(cè)定其生長(zhǎng)曲線,確定納豆菌最佳接種齡為6～10h。將納豆菌擴(kuò)大培養(yǎng)并制備凍干粉,其最適添

3、加量為0.1%。
　　 (2)通過(guò)GC-MS檢測(cè)分析并結(jié)合Guadagni香氣值理論,確定納豆的主要香氣成分為己醇、1-辛烯-3-醇、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮、2-庚酮、2,5-二甲基吡嗪等;經(jīng)超高壓400MPa處理10min能較好地保留并改善納豆的香氣;同時(shí)檢測(cè)出納豆香氣中有川芎嗪(四甲基吡嗪)的存在。
　　 (3)建立了高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵液中川芎嗪的方法,色譜柱為Agilent20RBAX.SBC18柱(

4、4.6mm×250mm,5μm),檢測(cè)條件:檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm;流動(dòng)相為水相(1%乙酸和0.05%三氟乙酸):甲醇=45:55(v/v);流速為0.8mL/min;進(jìn)樣量為2μL。該檢測(cè)方法精密度高(RSD<5%),穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好(RSD<5%),回收率在93%～98%之間,因此該方法適合發(fā)酵液中川芎嗪的檢測(cè)。
　　 (4)液體發(fā)酵液中川芎嗪的提取方法為:量取發(fā)酵液5mL,加20mL三氯甲烷超聲波萃取1h,真空抽濾后濾液加2

5、5mL0.2mol/L的鹽酸萃取。
　　 (5)通過(guò)單次因子法,確定葡萄糖為最佳碳源,最適濃度為1.5%;蛋白胨為最佳氮源,最適濃度為1%。將單次因子法和響應(yīng)面法(RSM)結(jié)合建立了納豆菌發(fā)酵液中川芎嗪含量和發(fā)酵條件(發(fā)酵溫度x1、接種量x2、發(fā)酵時(shí)間x3)之間的數(shù)學(xué)模型:Y=-235.42875+14.66062x1+8.2225x2+10.74625x3+0.011250x1x2-0.0325x1x3-0.3775x2x3-