川芎嗪對新生血管生成的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、新生血管生成是發(fā)生在胚胎時(shí)期和出生后的基本、普遍的生理過程，但是也是許多疾病如腫瘤、慢性炎癥和眼部血管增殖性疾病的重要病理表現(xiàn)。近年來，由于抑制新生血管生成可望成為治療腫瘤的有效策略，使得對新生血管生成和增殖的研究取得巨大發(fā)展。而除了腫瘤防治外，抑制新生血管的生成也為血管增殖性視網(wǎng)膜病變(如糖尿病視網(wǎng)膜病變、新生兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等)的防治帶來新的研究思路和方向。 血管增殖性視網(wǎng)膜病變是一類常見的致盲性眼病，許多疾病如

2、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等都可以引起血管增殖性的視網(wǎng)膜病變。該類疾病最終因視網(wǎng)膜新生血管增殖、出血和牽拉性視網(wǎng)膜脫離而導(dǎo)致的不可逆的失明。血管增生性視網(wǎng)膜病變是以視網(wǎng)膜新生血管生成和纖維增殖為主要特征的致盲性眼病，且發(fā)病確切機(jī)制不甚明了。目前研究結(jié)果認(rèn)為，病理性的血管增殖是由于血管生成的促進(jìn)和抑制因素之間失衡。其中VEGF是促血管生成中的關(guān)鍵因子。目前針對血管增生性視網(wǎng)膜病變的主要治療方法是激光和手術(shù)治療，

3、但效果欠佳。 中藥川芎嗪具有擴(kuò)張小動(dòng)脈、改善微循環(huán)障礙、清除氧自由基、抗脂質(zhì)氧化等藥理作用，臨床上已廣泛用于心腦血管性疾病和抗缺血再灌注損傷的治療。近年來一系列研究表明川芎嗪可抑制VEGF的表達(dá)，有臨床觀察提出川芎嗪可提高視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視力、減輕視網(wǎng)膜黃斑水腫，減緩病變發(fā)展。因此我們設(shè)想通過研究川芎嗪對體內(nèi)外新生血管生成的影響，以及探討川芎嗪對氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜血管增殖的抑制作用及其可能機(jī)制，探索一種有

4、效、實(shí)用的治療視網(wǎng)膜血管增殖性病變的藥物，此亦可惠及其他新生血管性疾病。 第一部分川芎嗪抑制雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成的作用研究 目的：觀察川芎嗪對雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成的抑制作用。 方法：將48只種蛋隨機(jī)分成4組，孵化條件為37.8±0.5℃，濕度保持在55％左右。孵育至第8天，在蛋殼上開一小窗，暴露絨毛尿囊膜，保持雞胚活力及卵黃膜的完整性。第9天將生理鹽水(組1)或不同劑量的川芎嗪與1％羥丙基甲基纖維素制

5、成混合物(組2，2.5ug/ul；組3，5.0ug/ul；組4，10ug/ul)備用。將甲潑尼龍琥珀酸鈉預(yù)處理的濾膜環(huán)(外環(huán)O7mm，內(nèi)環(huán)O5mm)小心置于絨毛尿囊膜上相對無血管區(qū)，然后將備好的混合物局部敷加在環(huán)內(nèi)，用微量進(jìn)樣器向?yàn)V膜環(huán)內(nèi)覆加各混合物10ul，即組1：NS(對照組)；組2，25ug/環(huán)；組3，50ug/環(huán)；組4，100ug/環(huán)。封上窗口繼續(xù)孵育。至第12天，將絨毛尿囊膜和濾膜環(huán)共同固定、收獲，并照相記錄。通過計(jì)數(shù)濾膜環(huán)內(nèi)

6、平均血管分叉數(shù)來評價(jià)血管密度。 結(jié)果：在雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)中，各組平均血管分叉數(shù)為148.7±38.0(組1，NS)，156.6±41.9(組2，川芎嗪25ug/環(huán))，99.6±34.6(組3，川芎嗪50ug/環(huán))，110.6±55.3(組4，川芎嗪100ug/環(huán))。與對照組平均血管密度相比，組4下降了25.6％(P=0.047＜0.05)，組3下降了33.0％(P=0.012＜0.05)。組2比組1略高5.3％(P=0.687

7、)，無顯著性差別。組3、4之間也無差別(P=0.539)。 結(jié)論：川芎嗪部分抑制雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成。 第二部分川芎嗪抑制氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜血管增殖及其機(jī)制研究 目的：運(yùn)用CD31免疫熒光標(biāo)記法，觀察川芎嗪腹腔注射對氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜血管增殖的影響，并探討其可能機(jī)制。 方法：建立氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜血管增殖模型。將40只C57BL/6J OIR模型小鼠隨機(jī)分為四組，在P12-P16，每天一次給小鼠腹腔注

8、射100mg/kg(第2組)、200mg/Kg(第3組)、400mg/Kg(第4組)的鹽酸川芎嗪注射液，以腹腔注射0.05ml生理鹽水作對照組(第1組)。至P17，免疫熒光法特異性標(biāo)記視網(wǎng)膜CD31抗原，鋪片，定量計(jì)算視網(wǎng)膜新生血管的面積。另外將12只小鼠隨機(jī)平分為兩組，造OIR模型，P12-P14分別注射生理鹽水和400mg/Kg鹽酸川芎嗪，于P12，P13，P14分次提取小鼠視網(wǎng)膜總RNA，用RT—PCR法檢測各時(shí)間VEGF及HIF

9、-1amRNA的表達(dá)。 結(jié)果：視網(wǎng)膜鋪片檢測視網(wǎng)膜新生血管面積：對照組2.26±0.94 m㎡，高劑量組(川芎嗪400mg/kg)為1.42±0.48 m㎡，中劑量組(川芎嗪200mg/kg)為1.70±0.61 m㎡，低劑量組(川芎嗪100mg/kg)為2.19±1.03 m㎡。與對照組相比，高劑量組OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管面積下降了37.0％(P=0.001)；中劑量組下降了24.8％(P=0.03<0.05)；低劑量組與對

10、照組無顯著性差異。各劑量組的結(jié)果存在明顯的劑量依賴性。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜組織在P12、P13、P14，VEGF mRNA表達(dá)平均下降了27.9％，13.8％，27.2％，HIF-1a mRNA表達(dá)27.5％，26.9％，43.4％。此外，免疫熒光特異性CD31抗原標(biāo)記法，可清晰顯示新生血管。 結(jié)論：腹腔注射川芎嗪可抑制氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管增殖，抑制效應(yīng)具有劑量依賴性。其抑制作用可能通過下調(diào)視網(wǎng)膜組織HIF-1a

11、及其下游VEGF mRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。 第三部分川芎嗪對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞二維血管結(jié)構(gòu)的影響 目的：觀察川芎嗪對體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞二維血管樣結(jié)構(gòu)形成的影響。 方法：用本課題組已建立的方法分離、培養(yǎng)、鑒定人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCECs)。將基質(zhì)膠(9.5mg/ml)以50ul/孔的量包被12孔板，37℃孵育30min。包被后向每孔中加入HRCECs約1×105/孔。將細(xì)胞分成4組，分別用無血

12、清內(nèi)皮培養(yǎng)基+生理鹽水(組1)和無血清培養(yǎng)基+川芎嗪(組2，100ug/ml；組3，200ug/ml；組4，400ug/ml)處理各組。1，2，4，6，8，10，16，24小時(shí)后，照相記錄細(xì)胞變化情況。 結(jié)果：將HRCEC種植于用基質(zhì)膠包被的12孔板內(nèi)，1h后細(xì)胞黏附在基質(zhì)膠上；隨后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，逐漸延長形成雙極樣細(xì)胞；細(xì)胞軸向延長、移行，形成相互吻合的細(xì)胞束(2-4h)；8-12h，最終形成二維血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；16-48

13、h，細(xì)胞束繼續(xù)拉升、變細(xì)，最后逐漸崩裂、塌陷并脫離培養(yǎng)皿。以上觀察到的結(jié)果在組2，3，4受到抑制和延遲，尤其以組4最為明顯。與對照組相比，經(jīng)川芎嗪處理12h后，各組無顯著性差異；24h后，高劑量組血管環(huán)平均面積為對照組的37.6％(P<0.001)，中劑量組為對照組的47.6％(P<0.001)，低劑量組為對照組的64.5％(P=0.005)。就殘留血管環(huán)平均數(shù)量而言，高劑量組殘留血管為對照組的2.9倍(P<0.001)，中劑量組為2.