原生質(zhì)體誘變選育高菊粉酶活釀酒酵母及其乙醇發(fā)酵研究.pdf

1、菊芋是一種多年生草本植物,是我國大規(guī)模經(jīng)濟地生產(chǎn)燃料乙醇的理想原料之一。菊芋干物質(zhì)的主要成分是菊粉。菊粉是由D-果糖經(jīng)β(1→2)糖苷鍵連接而成的線性臬聚糖,在菊粉酶的作用下可水解為易于乙醇發(fā)酵的果糖。乙醇工業(yè)生產(chǎn)上使用的釀酒酵母其乙醇發(fā)酵性能很好,但其菊粉酶活很低。盡管采用一些方法如紫外微波誘變進行菌種改良,但其菊粉酶活仍較低,這成為其作為乙醇發(fā)酵工業(yè)菌種的最大瓶頸。本課題以自篩選的釀酒酵母Y05為出發(fā)菌株,采用原生質(zhì)體誘變技術(shù)選育出

2、了較高菊粉酶活的釀酒酵母,并對其乙醇發(fā)酵性能進行了研究。
　　 原生質(zhì)體誘變的前提是原生質(zhì)體的制備。本課題采用蝸牛酶酶解法去除釀酒酵母Y05的細胞壁,然后在固體再生培養(yǎng)基上進行再生,從而獲得新的細胞菌落。通過進行單因素實驗和正交優(yōu)化實驗,得出釀酒酵母Y05原生質(zhì)體制備與再生最佳條件為:菌齡10h、蝸牛酶濃度為4%、預(yù)處理(預(yù)處理劑為0.2%巰基乙醇和0.1mol/LEDTA-Na2)時間10min、酶解溫度37℃、酶解時間2.5

3、h。其中菌齡、酶解濃度和酶解時間對原生質(zhì)體制備效果影響較大。在此條件下,原生質(zhì)體形成率和再生率分別達到了76.2%和15.4%。試驗發(fā)現(xiàn)使用蝸牛酶可有效的去除酵母細胞壁,原生質(zhì)體形成率可高達97%,但再生率很低,其原因尚不清楚。如何提高再生率進而改善原生質(zhì)體誘變效率有待進一步研究。
　　 本課題對所制備釀酒酵母Y05原生質(zhì)體進行了微波紫外復(fù)合誘變。經(jīng)過初篩與復(fù)篩,獲得6株正向突變明顯的菌株(Z1,Z4,Z6,Z7,Z10,Z15

4、),其菊粉酶活和乙醇合成能力均有一定程度的提高,其中突變菌株Z10性能最優(yōu),其菊粉酶活達到130.60U/mL,為出發(fā)菌株的1.88倍:突變菌株Z10的乙醇產(chǎn)量、乙醇得率、總糖利用率分別達到54.79g/L、0.445g/g和64.81%,比出發(fā)菌株分別提高了65.58%、19.95%和37.98%。
　　 在完成菌株改良的基礎(chǔ)上,本課題研究了溶氧對Z10菌株發(fā)酵菊粉生產(chǎn)乙醇的影響。試驗結(jié)果表明,盡管乙醇發(fā)酵是一個厭氧過程,但由