富鉬釀酒酵母的單倍體和原生質(zhì)體復(fù)合誘變選育及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、鋁(Molybdenum，Mo)是動(dòng)物、微生物及人體所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，是固氮酶、硝酸還原酶、黃嘌呤氧化酶、醛氧化酶、亞硫酸氧化酶等多種酶的重要組成成分，參與并影響機(jī)體內(nèi)的多種代謝過(guò)程，如參與細(xì)胞內(nèi)電子轉(zhuǎn)運(yùn)、機(jī)體內(nèi)鐵從鐵蛋白的釋放及鐵的運(yùn)輸、醛氧化等。鉬與乳腺癌、食道癌、心腦血管疾病、肝臟疾病、克山病、齲齒、小細(xì)胞低色素性貧血癥等病癥密切相關(guān)。 利用酵母富集轉(zhuǎn)化鉬具有結(jié)合率、利用率高和安全性好等特點(diǎn)，因此富鉬酵母作為機(jī)體鉬

2、源的補(bǔ)充，尤其是作為預(yù)防和治療癌癥、心腦血管疾病和肝臟疾病藥物的重要功效成分引起了人們的極大重視。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)誘變選育富鉬能力強(qiáng)的菌株，分析其生物學(xué)功能和黃嘌呤氧化酶、硝酸還原酶等酶活性，為富鉬酵母的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 對(duì)十株二倍體酵母菌株進(jìn)行鉬酸鈉液體抗性檢測(cè)后，篩選出一株鉬抗性高的二倍體釀酒酵母菌株Y1，其Na2MoO4抗性水平為20 mmol/L。通過(guò)Y1單倍體分離，并進(jìn)行液體抗性水平檢測(cè)，獲得高抗單倍體菌株，將其與單倍

3、體菌株SY10、SY11、SY12和SY14進(jìn)行不同終濃度的鉬酸鈉液體抗性水平檢測(cè)，篩選得到高抗單倍體菌株SY10(Na2MoO4抗性70mmol/L)，將其作為出發(fā)菌株。 以蝸牛酶酶解SY10制備原生質(zhì)體，并對(duì)其原生質(zhì)體和單倍體菌株進(jìn)行紫外線誘變，最佳照射時(shí)間分別為4 min和3 min。通過(guò)抗性水平檢測(cè)獲得了2株誘變菌株SY10-186p和SY10-150s(Na2MoO4抗性分別為300mmol/L和350 mmol/L)

4、，其拮抗Na2MoO4濃度分別為出發(fā)菌株的4.29倍和5.0倍。 分別將SY10-186p的原生質(zhì)體和SY10-150s的單倍體進(jìn)行紫外線再次誘變，最佳照射時(shí)間分別為4 min和6 min。通過(guò)抗性水平檢測(cè)獲得了2株誘變菌株SY10-186p-216u和SY410-150s-208u(Na2MoO4抗性均為400mmol/L)，其拮抗Na2MoO4濃度均為出發(fā)菌株的5.71倍，生物量分別為4.575 g/L，和1.610 g/L

5、，是出發(fā)菌株的1.75倍和1.94倍。通過(guò)原子吸收光譜法測(cè)定其鉬含量分別為38.52 mg/L和43.95 mg/L，為出發(fā)菌株的4.86倍和5.55倍。用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測(cè)定其有機(jī)鉬元素含量分別為15.87 mg/L和14.20 mg/L，為出發(fā)菌株的31.74倍和28.40倍。分別將SY10-186p的原生質(zhì)體和SY10-150s菌株的單倍體進(jìn)行微波復(fù)合誘變，微波源為2450 MHz，功率為850 W，最佳照射時(shí)間均為5

6、s。通過(guò)抗性水平檢測(cè)獲得了2株復(fù)合誘變菌株SY10-186p-8m和SY10-150s-48m(Na2MoO4抗性均為400 mmol/L)，其拮抗Na2MoO4濃度均為出發(fā)菌株的5.71倍，生物量為3.725 g/L和2.210 g/L，分別是出發(fā)菌株的1.42倍和2.66倍。通過(guò)原子吸收光譜法測(cè)定其總鉬含量分別為39.13mg/L和40.05 mg/L，為出發(fā)菌株的4.94倍和5.06倍。電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測(cè)定其有機(jī)鉬元素含

7、量分別為15.08 mg/L和17.24 mg/L，為出發(fā)菌株的30.16倍和34.48倍。 誘變菌株SY10-186p-216u、SY10-150s-208u、SY10-186p-8m和SY10-150s-48m的黃嘌呤氧化酶和硝酸還原酶的活性提高，分別為7.679U/L、7.380 U/L、7.679U/L、8.876 U/L和0.784 U/L、1.040 U/L、0.525 U/L、0.691U/L，是出發(fā)菌株的15.4

8、2倍、14.82倍、15.42倍、17.82倍和2.12倍、2.81倍、1.42倍、1.87倍。 在非重金屬選擇壓力下，50世代的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)表明，4株誘變菌株SY10-186p-216u、SY10-150s-208u、SY10-186p-8m和SY10-150s-48m的遺傳穩(wěn)定性均保持在90％以上。 生物學(xué)功能檢測(cè)結(jié)果表明，誘變菌株SY10-186p-216u、SY10-150s-208u、SY10-186p-8m