原生質(zhì)體融合技術(shù)選育高產(chǎn)乙醇酵母.pdf

1、發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇越來越受到人們的重視。目前，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的菌種主要以酵母菌為主。本課題主要的研究內(nèi)容是對發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的菌種誘變、篩選、馴化以及原生質(zhì)體融合，目的是篩選出耐高溫、耐乙醇且高效產(chǎn)乙醇的酵母菌株。 本文從實(shí)驗(yàn)室保藏的30℃米酒酵母M和市售安琪酵母A出發(fā)，分別進(jìn)行紫外（UV）和硫酸二乙酯（DES）復(fù)合誘變以及2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）顯色篩選。經(jīng)過UV+DES誘變后，米酒酵母M-UV-DES3（以下簡稱M-3

2、）在37℃下發(fā)酵糖醇轉(zhuǎn)化率為0．475 g·g-1，提高了10．9%。TTC法活化篩選安琪酵母A的結(jié)果表明活化后的安琪酵母純度高，產(chǎn)乙醇能力均一，糖醇轉(zhuǎn)化率普遍達(dá)到0．41g·g-1以上。其中A-837℃發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量為72 g·l-1，糖醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到0．481g·g-1。 考查了葡萄糖濃度對M-3和A-8的影響。當(dāng)初始葡萄糖濃度達(dá)到200g·l-1以上時，酵母受到乙醇和葡萄糖的雙重抑制，發(fā)酵最大乙醇濃度不再隨著葡萄糖濃度升高而

3、升高。故對其進(jìn)行乙醇濃度梯度馴化培養(yǎng)，以提高其耐乙醇性能。經(jīng)過多批次的馴化，M-3和A-8的耐乙醇濃度都達(dá)到120 g·l-1。 對馴化后的M-3和A-8進(jìn)行單倍體分離和篩選，從中選出生物量較高的單倍體SM-4（15．74 g·l-1）和乙醇含量較高的單倍體SA-5（127．5 g·l-1）作為原生質(zhì)體融合的親株。 對親株的原生質(zhì)體制備和再生條件進(jìn)行了試驗(yàn)，其最佳條件為：采用25ml0．05mol/L EDTA和Iml0

4、．5mol/lβ-巰基乙醇混合液預(yù)處理1h后，用4%的蝸牛酶酶解90min。親株SM-4的原生質(zhì)體形成率為89．3%，再生率為22．6%。親株SA-5的原生質(zhì)體形成率為91．45%，再生率為17．9%。 采用紫外滅活的方法對SM-4的進(jìn)行徹底滅活，條件為：20W紫外燈下距離20cm垂直照射4min。采用高溫?zé)釡缁畹姆椒▽A-5進(jìn)行徹底滅活，條件為：65℃下水浴處理30min。 用PEG誘導(dǎo)滅活的雙親原生質(zhì)體融合，經(jīng)TT

5、C平板初篩，發(fā)酵復(fù)篩以及多批次遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，獲得一株生物量高的高產(chǎn)乙醇融合株F-13，其生物量為26 g·l-1，乙醇產(chǎn)量為135 g·l-1，比親株SA-5和SM-4分別提高了7．3%和17%，耐乙醇能力達(dá)到160 g·l-1。 沿用米酒酵母和安琪酵母原生質(zhì)體制備融合的方法，以管囊酵母單倍體菌株1770 S-5和米酒酵母單倍體菌株SM-4為親株，對其原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱滅活和紫外滅活后融合。 對融合子TTC平板篩選，發(fā)