應(yīng)用滅活原生質(zhì)體融合法選育抗菌脂肽高產(chǎn)菌株.pdf

1、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)生不同種類的抗菌物質(zhì)，包括非核糖體合成的脂肽類抗生素（lipopeptide antibiotics）和核糖體合成的細(xì)菌素（bacteriocin）以及Bacillus subtilis抗菌蛋白。芽孢桿菌屬的細(xì)菌能夠產(chǎn)生多種脂肽類抗菌物質(zhì)，包括表面活性素、伊枯草菌素和芬薺素三大類，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒和支原體的功能，在生物醫(yī)藥方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，脂肽作為一種

2、生物表面活性劑在石油工業(yè)、食品、化妝品和農(nóng)業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。然而，較高的生產(chǎn)和回收成本限制了脂肽的工業(yè)化生產(chǎn)，因此尋找能夠提高脂肽產(chǎn)量、降低生產(chǎn)和回收成本的方法是目前迫切需要解決的問(wèn)題。本研究的目的在于，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保藏的兩株產(chǎn)抗菌脂肽的枯草芽孢桿菌，通過(guò)滅活原生質(zhì)體融合的手段選育抗菌脂肽高產(chǎn)菌株，提高脂肽產(chǎn)量。
　　 本研究主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面：
　　 1.研究了雙親菌株的培養(yǎng)條件，繪制了培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線，

3、確定了最佳的培養(yǎng)條件：將菌株接到斜面培養(yǎng)基活化24h，挑一環(huán)接至液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm，搖床培養(yǎng)14h，再按5％的接種量接至50mL菌體收集培養(yǎng)中，培養(yǎng)4-5h后收集。在確定了菌體培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上，對(duì)原生質(zhì)體制備與再生條件作了研究。fmbJ采用0.1mg/mL溶菌酶，在37℃下處理20min即可獲得98.3％的原生質(zhì)體，并且回復(fù)率達(dá)到10.6％；fmbR則采用37℃，1mg/mL處理40min后，破壁率達(dá)到了94.7％，回復(fù)率達(dá)

4、到了14.0％。
　　 2.分別對(duì)fmbJ、fmbR進(jìn)行熱滅活、紫外滅活，對(duì)滅活條件進(jìn)行研究。并對(duì)兩菌的滅活原生質(zhì)體進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)，并研究其融合條件，最終確定為：fmbJ采用熱滅活20min；fmbR采用紫外滅活60min。滅活后的原生質(zhì)體在40％PEG6000，在pH9.0下，37℃水浴10min，融合率達(dá)到6.97×10-7。
　　 3.取134株融合后菌株發(fā)酵篩選，將優(yōu)良融合子傳代10代，發(fā)酵后通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)及高效液相

5、色譜（HPLC）檢測(cè)其產(chǎn)抗菌肽能力。最終得到一株融合子F22，發(fā)酵抗菌脂肽粗提物對(duì)大腸桿菌、藤黃微球菌、熒光假單孢菌較親本菌株有明顯提高，經(jīng)高效液相色譜分析，F(xiàn)22較fmbJ，surfactin物質(zhì)提高了約1.75倍，而Fengycin的兩組分則分別提高了40％和26％。
　　 4.利用AFLP技術(shù)對(duì)融合子與雙親菌株的基因組DNA進(jìn)行比較，電泳結(jié)果表明融合子F22與親本菌株存在顯著差異，從而在分子水平上進(jìn)一步驗(yàn)證F22為融合子。