原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行纖維素酶新菌株的選育及發(fā)酵研究.pdf

1、StudiesonthebreedingofnewcellulaseStrainbyprotoplastfusionandtheFermentationProcessLiMiaoAthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofScience1nFermentationEngineeringlnCentralSouthUniversit

2、yofForestryandTechnology498ShaoshanSouthRoad，TianxinDistrictChangshaHunan410004，PRCHINASupervisorProfessorZENGBai—quanMay20t4摘要纖維素酶(cellulase)nI“降解纖維素為糖類被人類利用，故被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前國內(nèi)外對纖維素酶的研究主要以木霉屬、青霉屬、曲霉屬的真菌為主。青霉屬(Penicillium)

3、真菌可分泌較為全面的聚糖酶系，而且酶系中p葡萄糖苷酶的量比木霉纖維素酶分泌的更多，但是青霉屬真菌對酸堿及溫度的適應(yīng)性不強(qiáng)，所產(chǎn)纖維素酶的活力不高。枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)具有耐熱、耐酸堿、耐旱、抗紫外線和耐有機(jī)溶劑等強(qiáng)抗逆性。選用產(chǎn)纖維素酶的青霉Q5和具有抗逆性的枯草芽胞桿菌K3為親本，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，獲得既能夠分泌高產(chǎn)纖維素酶又具有強(qiáng)抗逆性的融合菌株，其研究結(jié)果如下：通過對菌體生長濃度測定、顯微鏡觀察計(jì)數(shù)

4、和再生率計(jì)算等方法，對雙親原生質(zhì)體的形成與再生進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：親本菌株青霉Q5酶解前，在其菌絲培養(yǎng)液中加入質(zhì)量濃度05％的甘氨酸和質(zhì)量濃度10％的蔗糖，能夠促使菌絲體較好的分散，利于酶解；在溶茵酶和蝸牛酶共同作用下進(jìn)行酶解，質(zhì)量濃度均為10mg／ml：35℃處理3h；原生質(zhì)體生成量達(dá)到最大值，為685106cfu／mL；親本菌株枯草芽胞桿菌K3酶解前，用4U／mL的青霉素處理，在1mg／mL的溶菌酶作用下，35℃處理lh，原生質(zhì)體量

5、達(dá)到最大值，為146107cfu／mL。利用高溫和紫外照射的處理方式對原生質(zhì)體滅活，通過原生質(zhì)體的再生率確定雙親原生質(zhì)體的滅活條件。結(jié)果表明，在65。C的水浴處理下，青霉菌Q5最佳熱滅活的時間為2h，枯草芽胞桿菌K3最佳熱滅活的時間是25h：在距30W紫外燈20cm處照射下，Q5最佳紫外滅活時間為15min；K3最佳紫外滅活時間為25min。采用聚乙二醇(PEG)法和高Ca2高pH法相結(jié)合誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，通過正交分析，得到融合的最佳條

6、件是融合溫度為38℃，融合時間10min，PEG濃度為40％，在該條件下的融合率為30810一。依據(jù)再生培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落的形態(tài)和顏色，以及在剛果紅培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的透明圈大小進(jìn)行分離，獲得了5株融合子，分別是R8，R17，R35，R62，R158菌株。通過形態(tài)特征觀察、生理生化分析、遺傳穩(wěn)定性及抗逆性研究，篩選獲得了性狀優(yōu)良(酶活較高且抗逆性較強(qiáng))的融合子R62，該融合子在pH8時保留pH6時酶活的7401％，在pH10時保留了其在pH6