大曲華根霉(Rhizopus chinensis)固態(tài)發(fā)酵表達酯合成脂肪酶的研究.pdf

1、華根霉(Rhizopus chinensis CCTCC M201021)是從白酒大曲中分離得到的一株絲狀真菌，其在固態(tài)發(fā)酵過程中能夠合成多種酯合成脂肪酶。為研究華根霉固體發(fā)酵產酯合成脂肪酶的特點和形成機理，本論文開展了系統(tǒng)的研究。通過優(yōu)化華根霉固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)條件和參數(shù)，大量制備菌體結合酯合成脂肪酶，然后對這些脂肪酶蛋白進行分離純化和酶學性質研究，并在蛋白質分子水平上與液體培養(yǎng)條件下的脂肪酶進行對比，發(fā)現(xiàn)和確認了固態(tài)發(fā)酵所特有的酯合成脂

2、肪酶，并詳細分析固態(tài)發(fā)酵特殊的環(huán)境條件對特征性脂肪酶產生的影響，揭示了誘導特征性酯合成脂肪酶表達的關鍵兇素。具體結果如下：
　　 (1)華根霉固體發(fā)酵產全細胞酯合成脂肪酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化
　　 為進一步提高華根霉菌體結合脂肪酶的生產水平，獲得一定數(shù)量的目的酶用于后續(xù)研究，對發(fā)酵培養(yǎng)基各主要成分含量和發(fā)酵條件進行了單因素考察和優(yōu)化。以脂肪酶合成活性為指標，得到的培養(yǎng)基組成為(w/w)：小麥18%，麩皮12%，乳糖2%

3、(補充碳源)，蛋白胨2%(補充氮源)，橄欖油2%(v/w，誘導物)，K2HPO40.3%，MgSO4·7H2O0.07%；最佳產酶條件為：起始水分含量70%，接種量106孢子/g干基，培養(yǎng)溫度30℃，初始pH值6.5，培養(yǎng)時間72 h。優(yōu)化后的培養(yǎng)基將菌體結合酯合成脂肪酶的活力提高至24432 U/kg干基，為優(yōu)化前培養(yǎng)基酶活的4.1倍。
　　 (2)華根霉固態(tài)發(fā)酵酯合成脂肪酶的分離純化
　　 為在蛋白質水平上研究固態(tài)發(fā)

4、酵表達的酯合成脂肪酶，需要對其進行分離純化。將R.chinensis固體發(fā)酵的細胞破碎后，利用Triton X-100提取胞膜粗蛋白，然后經過硫酸銨沉淀、丁基疏水層析和Superdex75凝膠過濾層析得到兩個酯合成脂肪酶同工酶，分別命名為SSL1和SSL2。SSL1的分子量約為64 kDa，SS L2的分子量是33 kDa。利用相同的步驟純化R.chinensis液態(tài)發(fā)酵的酯合成脂肪酶，也得到了兩個脂肪酶同工酶，分別是SML1和SML2

5、。通過N端序列和肽質量指紋圖譜比對，發(fā)現(xiàn)SSL2是固體發(fā)酵和液體發(fā)酵的共有蛋白質，而SSL1則可能是與固體發(fā)酵相偶聯(lián)的特征性脂肪酶，而且SSL1與已報道的根霉脂肪酶的同源性很低，應該是一種新型的脂肪酶。
　　 (3)固態(tài)發(fā)酵特征性酯合成脂肪酶(SSL1)的生化性質研究
　　 以水解活性為表征，對純化的固態(tài)發(fā)酵特征性酯合成脂肪酶(SSL1)的酶學性質進行研究，結果表明，SSL1水解活性的最適反應溫度是40℃，其在50℃以下

6、保留1h仍然能維持原始活性的80%以上；最適反應pH為8.0，在pH6.5～8.0的條件下也比較穩(wěn)定。K+顯著提高了SSL1的水解活性，而Cu2+和Hg2+則完全抑制了其活性。純化的SSL1對三氯甲烷、正己烷等有機溶劑有較好的耐受性。底物特異性研究表明，該脂肪酶對中長鏈的脂肪酸酯具有較高的水解活性，對硝基苯酚棕櫚酸酯(C16)是其最適底物。以合成活性為表征，純化的SSL1最適pH記憶是7.5，最適反應溫度是30℃。在有機相中催化合成脂肪

7、酸乙酯的研究表明，以乙醇為?；荏w時，SSL1的最佳?；w足肉豆蔻酸，而且對于碳鏈長度大于8的中長鏈脂肪酸，該脂肪酶也表現(xiàn)出較高的酯合成的能力。
　　 將SSL1與液態(tài)發(fā)酵特殊的酯合成脂肪酶(SML1)進行對比，發(fā)現(xiàn)SSL1在熱穩(wěn)定性及有機溶劑耐受性等方面顯著優(yōu)于SML1。另外，兩者在金屬離子的影響、水解底物特異性、pH記憶以及合成反應的最佳酰基供體等酶學特性和催化特性上也存在一定差異。
　　 (4)抗SSL1兔多克隆

8、抗體的制備以及SSL1特征性的驗證
　　 為了驗證SSL1是固體發(fā)酵過程中產生的特征性酯合成脂肪酶，利用純化的SSL1為抗原免疫新西蘭大白兔制備抗SSL1多克隆抗體，經4次免疫后，血清效價達1：10000。多克隆抗體經Protein A親和柱層析后，純度完全符合檢測要求。利用免疫印跡分析固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的蛋白表達情況，結果表明，多克隆抗體能夠與固體發(fā)酵的胞內和胞膜粗蛋自發(fā)生特異性反應，證明SSL1存在于固體發(fā)酵的細胞內和細胞膜

9、上；但是抗SSL1多克隆抗體不能與液體發(fā)酵的任何組分(細胞內、細胞外和細胞膜)發(fā)生特異性反應，說明SSL1在液體發(fā)酵過程中沒有表達。
　　 (5)固態(tài)發(fā)酵非特征性酯合成脂肪酶(SSL2)的生化性質研究
　　 以水解活性為表征，對純化的固態(tài)發(fā)酵非特征性酯合成脂肪酶(SSL2)的酶學性質進行研究，結果表明，SSL2水解活性的最適反應溫度是40℃，在35℃以下較為穩(wěn)定；最適反應pH為8.5，在pH5.5～7.0的環(huán)境中也較為穩(wěn)

10、定。Mn2+顯著提高了該脂肪酶的水解活性，而Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e2+，Hg2+和Fe3+則強烈抑制了這一活性。純化的SSL2對甲醇、乙醇、正己烷和異辛烷等有機溶劑有較好的耐受性，而其他溶劑使脂肪酶失活嚴重。底物特異性研究表明，SSL2對對硝基苯酚月桂酸酯(C12)的脂肪酸鏈長特異性最高，對中長鏈的脂肪酸酯也具有較高的水解活性。以合成活性為表征，純化的SSL2的最適pH記憶和反應溫度分別是6.0和30℃；在有機相中催化合成反應的脂肪酸

11、和脂肪醇的底物特異性研究表明，該酶的最適底物脂肪酸是正辛酸，最適底物脂肪醇是正丁醇。
　　 將SSL2與液態(tài)發(fā)酵非特征性酯合成脂肪酶SML2進行對比，發(fā)現(xiàn)兩者的酶學特性和催化特性基本相同，但是SSL2比SML2最適反應溫度更高。另外，兩者在金屬離子的影響、有機溶劑耐受性等酶學特性上也存在些許差異。
　　 (6)誘導SSL1表達的固態(tài)發(fā)酵關鍵因素的考察
　　 結合Western blotting和間接Elisa法研

12、究固態(tài)發(fā)酵特殊的環(huán)境因素對SSL1的誘導作用，發(fā)現(xiàn)界面的存在和較高的培養(yǎng)溫度皆不是誘導SSL1產生的關鍵參數(shù)。在平板培養(yǎng)和標準固態(tài)發(fā)酵中的各層菌絲體中，SSL1都在營養(yǎng)菌絲體中高量表達，而氣生菌體以及菌膜都不利于產SSL1，所以氣生菌絲體的存在可能與SSL1的表達沒有直接聯(lián)系。低水活度是誘導SSL1產生的一個關鍵因素，降低培養(yǎng)基的水活度能夠誘導SSL1生成，并且與調節(jié)水活度的化合物無關；而且在發(fā)酵后培養(yǎng)的過程中，降低水活度仍然可以提高S