華根霉rhizopuschinensis前導(dǎo)肽和成熟肽脂肪酶在e.coli中的克隆表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究

1、江南大學(xué)碩士學(xué)位論文華根霉（Rhizopus chinensis）前導(dǎo)肽和成熟肽脂肪酶在E.coli中的克隆表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究姓名：李飏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師：徐巖;王棟20080801A b s t r a c tA b s t r a c tR h i z o p u sl i p a s e i s at y p i c a l k i n do fM i c r o b i a l L i p a s e ，w

2、 h i c hh a sai m p o r t a n tr o l e i nt h e o r e t i c a l r e s e a r c h a n d p r a c t i c a l a p p l i c a t i o n ，b e c a u s e o f t h e i r p a r t i c u l a r c a t a l y t i cc h a r a c t e r i s t i c

3、s ．R h i z o p u sc h i n e n s i sl i p a s e ( R C L ) h a sg o o da p p l i c a t i o ni n i n d u s t r i a lp r a c t i c e ，s u c h a s s y n t h e s i s o f e s t e r s ，p r e p a r a t i o n o f b i o d i e s e l

4、 a n d c h i r a l c o m p o u n d s ．E x p r e s s i o nR h i z o p u s c h i n e n s i sl i p a s e sa n d r e s e a r c h t h e i rc h a r a c t e r i s t i c s w a s t h eb a s i co f f u r t h e rr e s e a r c hf o

5、r t h e o r e t i c a la n d a p p l i c a t i o no f R C L ．T or e a c hr e l a t i v ec o m p r e h e n s i v ek n o w l e d g eo fR h i z o p u sc h i n e n s i s l i p a s e s ，e x p r e s s i o nt h el i p a s eg e

6、n ei na c c u r a t ew a y a n d g u i d e t h ei n d u s t r i a la p p l i c a t i o n ，t h ep r o l i p a s ea n d m a t u r el i p a s eg e n e sw e r ea m p l i f i e d b y P C R m e t h o d u s i n gt h eg e n o m

7、i c D N A i s o l a t e df r o m R h i z o p u sc h i n e n s i sC C T C C M 2 0 10 2 1 ．T h et a r g e t g e n e sw e r et h e n i n s e r t e di n t o t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp E T - 2 8 a a n d e x p r e s

8、s e d i nE ．c o l iB L 2 1 、Ⅳi t l lI P T G i n d u c t i o n ．S D S —P A G Ea n a l y s i ss h o w e dt h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h t o f p r o - a n d m a t u r e R h i z o p u sc h i n e n s i s l i p

9、 a s e s ( P r o R C L a n dM R C L )w e r ea b o u t4 3k Da n d 3 3 k D ，r e s p e c t i v e l y ．U n d e rt h ec o n t r o lo fc o n d i t o n ，p r o —a n dm a t u r eR h i z o p u sc h i n e n s i sl i p a s e se x p

10、r e s s e d i nE ．c o l ic o u l d o b t a i na c t i v ef o r m s ．T h et a r g e tp r o t e i n sw e r e p u r i f i e db y t h e a f f i n i 夠c h r o m a t o g r a p h ．T h e P r o R C La n dM R C L s h o w e ds i m i

11、 l a rc h a r a c t e r i s t i c s ，o p t i m a lt e m p e r a t u r e a t3 5 “ { 2 ，s t a b l eb e l o w 4 0 “ ( 3 ，o p t i m a lp Ha t 8 ．0 a n d8 ．5 r e s p e c t i v e l y ．T h e s et w or e c o m b i n a n t l i p

12、a s e sw e r e s p e c i f i c t o s h o r t c h a i nf a t t y a c i d o f P - n i t r o p h e n y l e s t e r s ．T h e K m a n dk 砒f o rt h eh y d r o l y s i so f P - - n i t r o p h e n y l p a l m i a t ea n d P - -

13、 n i t r o p h e n y lp r o p i o n a t e o f P r o R C La n dM R C Le x p l a i n e dt h a t t h eh y d r o l y t i c a c t i v i t y o fb o t he n z y m e u s i n g P - n i t r o p h e n y lp r o p i o n a t e a ss u b

14、 s t r a t e w e r eh i g h e rt h a nt h a to f p - n i t r o p h e n y lp a l m i a t e ．B o t h l i p a s e sw e r es t i m u l a t e db y10m m o l ／LM ∥十，w h i l eH g p 、S D Sa n dP M S F h a ds t r o n g i n h i b i

15、 t i o n o nt h e i ra c t i v i t i e s ．T h er e s u l t ss h o w e dp r o s e q u e n c e h a d n oo b v i o u s e f f e c t so n t h ec h a r a c t e r i s t i c so f R C L ，w h i c hw a sd i f f e r e n t f r o m R

16、h i z o p u so r y z a e l i p a s e ( R O L ) ．K e yw o r d s ：R h i z o p u s c h i n e n s i s ，P r o l i p a s e ，M a t u r e l i p a s e ，C l o n i n g ，E x p r e s s i o n ，a f f i n i t yc h r o m o g r a p h y ,