華根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶的基因克隆、表達(dá)，純化和酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、生物催化在工業(yè)應(yīng)用的過程中，一個很大的限制因素就是催化劑脂肪酶。自然條件下，菌株產(chǎn)脂肪酶量較低，利用常規(guī)育種方法難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。本論文從華根霉(Rhizopuschinensis)CCTCCM201021中首次克隆得到其脂肪酶全基因，并實現(xiàn)了華根霉脂肪酶前導(dǎo)肽和成熟肽在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中的高水平分泌表達(dá)，初步分離純化后對比了兩重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)差異，為華根霉脂肪酶的進(jìn)一步理論研究及其應(yīng)用奠定了基

2、礎(chǔ)。主要研究結(jié)果包括： (1)以實驗室保藏菌種華根霉基因組為模板，利用根霉通用引物PCR擴(kuò)增得到華根霉18SrDNA片段，鑒定其種屬。根據(jù)Rhizopusstolonifer和Rhizopusoryzae脂肪酶基因序列比對后設(shè)計調(diào)取華根霉脂肪酶基因的引物，利用兩次PCR程序分別獲得華根霉脂肪酶上、下游片段，拼接后得到華根霉脂肪酶全基因(RCL)。該基因的開放閱讀框長1170bp，不含內(nèi)含子，編碼一個389個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。包

3、括26個氨基酸的信號肽，94個氨基酸的前導(dǎo)序列和269個氨基酸的成熟肽，其推斷的氨基酸序列與一些已報道的根霉脂肪酶序列同源性為86％。 (2)構(gòu)建酵母分泌型表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9k-proRCL和pPIC9k-mRCL，將重組表達(dá)質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母。構(gòu)建了GS115/pPIC9k-proRCL用于分泌表達(dá)前導(dǎo)肽脂肪酶，表型包括His+Muts和His+Mut+；構(gòu)建了GS115/pPIC9k-mRCL用于分泌表達(dá)成

4、熟肽脂肪酶，表型包括His+mats和His+mut+。SDS-PAGE分析表達(dá)的慢生型前肽脂肪酶的分子量為37kD左右，最大分泌表達(dá)量為0.85mg/mL，占分泌蛋白總量的68.3％，pNPP法測得此時的脂肪酶水解活力為121.2U/mL;表達(dá)的慢生型成熟肽脂肪酶的分子量為30kD左右，最大分泌表達(dá)量為0.16mg/mL，占分泌蛋白總量的21.6％，pNPP法測得此時的脂肪酶水解活力為4.3U/mL。 (3)將重組巴斯德畢赤酵

5、母GS115/pPIC9k-proRCLMuts和GS115/pPIC9k-mRCLMuuts發(fā)酵上清液經(jīng)過10KD超濾膜濃縮，SP-SepharoseFF強(qiáng)陽離子交換層析和Phenyl-Sepharose6FF疏水色譜柱層析后得到脂肪酶活性組分proRCL和mRCL。純化后的重組蛋白proRCLN-端氨基酸測序分析表明該重組脂肪酶是加工過的產(chǎn)物，分泌表達(dá)的重組脂肪酶只保留了前導(dǎo)序列C-端的27個氨基酸和成熟肽的269個氨基酸，簡稱pr

6、027RCL。酵母菌GS115/pPIC9k-pr027RCL和GS115/pPIC9k-mRCL的表達(dá)上清液在用EndoH處理前與處理后其蛋白分子量沒有發(fā)生變化，表明該酵母表達(dá)的重組脂肪酶都未進(jìn)行N端糖基化修飾。 (4)通過對重組脂肪酶pr027RCL和mRCL的酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)pro27RCL和mRCL的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度相近，最適pH值分別為8.5和8.0，最適反應(yīng)溫度分別為40℃和35℃。但底物選擇性和動力學(xué)常

7、數(shù)差異較大。pro27RCL對C6-C8中鏈脂肪酸酯水解活力較高，而mRCL對pNPC2的水解活力最高，對C2-C6的短鏈脂肪酸酯水解活力較高，分類學(xué)上更傾向于酯酶(EsteraseE.C.3.1.1.2)。兩脂肪酶對對硝基苯酚棕櫚酸酯的Km和Vmax分別為0.304mmol/L、0.345mmol/L和3.38μmol/min/mL、0.074μmol/min/mL。pro27RCL，和mRCL對三油酸甘油酯均沒有位置選擇性。10mm