基于Western Blot分析的華根霉液態(tài)發(fā)酵菌體形態(tài)與其膜結(jié)合脂肪酶生產(chǎn)間規(guī)律的研究.pdf

1、脂肪酶能夠水解脂肪為甘油和脂肪酸,也可催化非水相酯合成,具有區(qū)域選擇性、對映選擇性和高底物專一性。用于有機相合成的、具有酯化或轉(zhuǎn)酯化功能的脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)對于酶催化合成手性化合物和精細(xì)化學(xué)品有重要意義。華根霉脂肪酶因其高酯化合成能力,在生物能源、香精香料等相關(guān)產(chǎn)業(yè)具有廣泛應(yīng)用潛力。前期研究發(fā)現(xiàn),華根霉搖瓶水平液態(tài)發(fā)酵過程中,能夠隨機產(chǎn)生不同形態(tài)華根霉菌體,伴隨菌體形態(tài)的改變,華根霉膜結(jié)合脂肪酶合成活性變化顯著。本論文針對華根霉菌絲體形

2、態(tài)進行液態(tài)發(fā)酵初步調(diào)控,進而利用Western Blot反應(yīng)初步研究華根霉菌體形態(tài)與具有合成活性膜結(jié)合脂肪酶生產(chǎn)之間的關(guān)系,最后在發(fā)酵罐水平進行華根霉發(fā)酵初步調(diào)控并驗證了所產(chǎn)脂肪酶在非水相合成短鏈脂肪酸酯的應(yīng)用,摘要如下:
　　 (1)華根霉液態(tài)發(fā)酵搖瓶水平菌體形態(tài)初步調(diào)控。利用本研究室保藏的華根霉菌株(Rhizopus chinensis CCTCC M201021),在搖瓶水平研究了搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、擋板條件、接種量、發(fā)酵液

3、初始pH及橄欖油添加量等因素對華根霉菌體形態(tài)的影響,實現(xiàn)華根霉搖瓶水平不同菌體形態(tài)的初步調(diào)控。確定影響華根霉菌體形態(tài)的關(guān)鍵因素為裝液量和擋板條件。塊狀菌體形成條件:裝液量20mL/250 mL發(fā)酵搖瓶;搖床轉(zhuǎn)速200 rpm;發(fā)酵液初始pH5.5;接種量5×107spores/mL;培養(yǎng)溫度30℃。此條件下,華根霉菌體形態(tài)維持光滑塊狀,脂肪酶合成活性最高。通過調(diào)節(jié)裝液量至40 mL及添加擋板能夠分別獲得球狀菌體及散裝菌體。
　　

4、 (2)Western Blot分析華根霉菌體形態(tài)及其與合成活性膜結(jié)合脂肪酶生產(chǎn)的關(guān)系。制備得到華根霉膜結(jié)合脂肪酶(sRCL)抗血清并利用Protein A純化得到sRCL的特異性多克隆抗體。利用sRCL特異性多克隆抗體,通過Western Blot反應(yīng),并結(jié)合脂肪酶活性分析,檢測不同菌體形態(tài)下胞內(nèi)酶、膜結(jié)合脂肪酶及胞外酶的產(chǎn)生及分布情況。結(jié)果顯示,隨著華根霉菌體形態(tài)不斷聚集,華根霉膜結(jié)合脂肪酶積累量增加,對應(yīng)脂肪酶合成活性增加明顯。同

5、時,菌體形態(tài)的改變顯著影響不同區(qū)域脂肪酶的分布,即華根霉菌體聚集能夠明顯抑制脂肪酶由細(xì)胞內(nèi)向胞外分泌。
　　 (3)發(fā)酵罐水平華根霉初步發(fā)酵調(diào)控。華根霉聚集態(tài)菌體有利于華根霉合成活性膜結(jié)合脂肪酶發(fā)酵水平的提高,但在普通機械攪拌發(fā)酵罐中華根霉無法形成聚集態(tài)菌體,導(dǎo)致無法有效獲得具有有機相酯合成活力的膜結(jié)合脂肪酶。針對此問題,自行設(shè)計支撐網(wǎng)桶裝置,使華根霉菌絲體能附著網(wǎng)桶生長,獲得聚集態(tài)菌體。相對普通機械攪拌發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)生的散裝菌