新城疫病毒HN蛋白在病毒毒力和組織嗜性中的作用.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)危害極為嚴(yán)重的一種烈性傳染病，經(jīng)過(guò)四次世界大流行后，其感染的宿主范圍己明顯擴(kuò)大，并且表現(xiàn)出新的生物學(xué)特性。過(guò)去，．雖然也有報(bào)道NDV能自然感染鵝、鴨等水禽，但一般認(rèn)為水禽對(duì)NDV有較強(qiáng)的抵抗力，感染后不易發(fā)病和造成流行。然而，自90年代后期，我國(guó)陸續(xù)有水禽感染NDV強(qiáng)毒并發(fā)病的報(bào)道，NDV的生物學(xué)特

2、性變化及鵝源病毒的來(lái)源，已引起了研究者們的重視。Hemagglutinin-neuraninidase（HN)蛋自是病毒表面重要的囊膜糖蛋白之一，它介導(dǎo)了病毒與宿主細(xì)胞受體的特異性結(jié)合，同時(shí)，在促進(jìn)F蛋白融合與子代病毒釋放方面也扮演了重要的角色。因此，進(jìn)一步研究HN蛋白在病毒致病機(jī)制中的作用，將具有非常重要的意義。 基予以上背景，本研究首次以NDV強(qiáng)毒株ZJ1為骨架，通過(guò)反向遺傳技術(shù)將毒力更強(qiáng)的基因Ⅶ型強(qiáng)毒株14和基因II型弱毒

3、株Clone30的HN基因分別替換到該骨架中并拯救出相關(guān)重組病毒，再分別以細(xì)胞、雞胚和小雞為動(dòng)物模型進(jìn)行了相關(guān)生物學(xué)試驗(yàn)以重點(diǎn)闡明HN蛋自與病毒毒力及組織嗜性之聞的關(guān)系。 1.相關(guān)重組嵌合體病毒的構(gòu)建及拯救首先，透過(guò)PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)中聞轉(zhuǎn)移質(zhì)粒R123實(shí)施序列修飾后使HN基因的兩端出現(xiàn)單酶切位點(diǎn)AflII和SspI，從而方便HN基因的完整替換。然后，通過(guò)PCR擴(kuò)增出Clone30株和I4株的HN基因，目的片段經(jīng)AflII和

4、SspI酶切后連入中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒mRl23中，再經(jīng)AgeI和FspAI酶切后連入全長(zhǎng)質(zhì)粒pZJI中得到重組質(zhì)粒pZJl/ClonHN和pZJl/I4HN。圊時(shí)pUC/NDV-GFP經(jīng)AgeI和BstZl7I酶切后將含有GFP的片段插入到重組質(zhì)粒pZJl/ClonHN和pZJl/I4HN的P和M基因之間后得到了重組質(zhì)粒pZJl/ClonHN-GFP和pZJl/14HN-GFP。將重組質(zhì)粒分別和pCI-NP、pCI-P、pCI-L輔助表達(dá)質(zhì)粒

5、共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞后，成功拯救出了重組病毒rZJl/ClonHN、rZJl/14HN、rZJl/ClonHN-GFP和rZJl/14HN-GFP。測(cè)序結(jié)果表明，I4株和Clone30株的HN基因已替換到骨架病毒的基因組中，同時(shí)GFP基因也已正確插入到重組病毒的基因組中。 2.HN基因的替換對(duì)重組嵌合體病毒生物學(xué)特性造成的影響。 2.1重組病毒在細(xì)胞模型上的生物學(xué)特性差異病毒生長(zhǎng)動(dòng)力曲線、感染細(xì)胞后的病變和空斑形態(tài)

6、等分析結(jié)果顯示，I4株和Clone30 株的HN基因在強(qiáng)毒骨架上能很好地發(fā)揮其生物學(xué)功能，重組病毒rZJl/ClonHN、rZJl/I4HN與骨架病毒rZJl表現(xiàn)出相似的多步生長(zhǎng)曲線、一致的細(xì)胞病變和空斑形態(tài)，只是rZJl/ClonHN的生長(zhǎng)速度略微緩慢。 2.2 HN基因的替換對(duì)重組病毒毒力的影響通過(guò)測(cè)定MDT、ICPI、IVPI三大毒力指標(biāo)，我們分析了HN基因?qū)χ亟M病毒毒力的影響。結(jié)果表明，與骨架病毒rZJl相比，rZJl/

7、14HN不影響ICPI的變化，但略微提高了IVPI值和縮小了MDT值；rZJl/ClonHN不影響ICPI和IVPI的變化，但增大了MDT值。 鑒于NDV主要通過(guò)消化道和呼吸道感染傳播，我們研究了重組病毒在滴鼻、點(diǎn)眼的自然感染途徑下對(duì)宿主致病性的影響。結(jié)果表明，與骨架病毒rZJl相比，rZJl/I4HN能增強(qiáng)對(duì)小雞的致病力；rZJl/ClonHN能降低對(duì)小雞的致病力。2. 3.HN基因的替換對(duì)組織感染嗜性的影響前面研究發(fā)

8、現(xiàn)，在通過(guò)尿囊腔接種和滴鼻、點(diǎn)眼接種時(shí)，HN蛋白對(duì)病毒的致病性影響更加的明顯。為了研究上述差異的原因，我們以GFP標(biāo)記的重組病毒分別感染雞胚和小雞，然后觀察熒光在組織中的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與骨架病毒rZJl-GFP相比，rZJl/I4HN-GFP能夠廣泛地分布到各個(gè)組織臟器中；rZJl/ClonHN-GFP分布的組織范圍明顯縮小，熒光量減少。 通過(guò)免疫組化技術(shù)分析了重組病毒和骨架病毒的組織嗜性分布情況。結(jié)果表明，骨架病毒rZJ

9、l在除了肺臟和脾臟外的其它組織均有分布，腦中病毒分布量較少；rZal/I4HN在除了肺臟以外的其它組織中均有分布，并且范圍較廣，分布量較多；rZal/ClonHN只在氣管、腎臟、肝臟中有分布，并且范圍較窄、量較少；結(jié)論：本研究主要發(fā)現(xiàn)為：(1)異源HN蛋白在強(qiáng)毒骨架病毒上仍然能很好地發(fā)揮其生物學(xué)功能；(2)HN蛋白對(duì)病毒的毒力具有一定的影響作用；(3)HN蛋白能夠影響病毒的組織感染嗜性，我們推測(cè)可能正是這種差異性導(dǎo)致了它對(duì)病毒毒力的影響